Generación in vitro de células dendríticas plasmocitoides a partir de progenitores linfoides comunes

Las células dendríticas plasmocitoides, o pDC, son células inmunitarias que responden a la infección produciendo la citocina interferón tipo I.

Para generar pDC in vitro, tome una suspensión de células progenitoras linfoides comunes, o CLP, aisladas de la médula ósea de ratón. Los CLP pueden diferenciarse en linfocitos y células dendríticas.

Agregue la suspensión celular sobre una capa de células alimentadoras (células estromales adherentes) irradiadas con rayos gamma para inhibir la proliferación. Las células alimentadoras proporcionan citocinas y contacto célula-célula necesarios para la diferenciación de los CLP.

Agregue una concentración adecuada de ligando tirosina quinasa 3 similar a Fms, o FL, una citocina bivalente que promueve el desarrollo de pDC, e incube.

Los CLP migran entre las células alimentadoras y proliferan para formar grupos de células, denominadas áreas empedradas.

El FL en el medio se une al receptor Flt3, un receptor de tirosina quinasa, en los CLP. La unión induce la dimerización del receptor y la autofosforilación de los residuos de tirosina en el dominio citoplasmático.

Las proteínas adaptadoras citoplasmáticas se unen a estos residuos y se fosforilan, transduciendo la señal a los componentes de señalización aguas abajo. La cascada de señalización provoca la diferenciación de los CLP en pDC, pequeñas células redondas que crecen en suspensión, así como en células dendríticas convencionales, o cDC, células adherentes más grandes en forma de huso.

Recoge las células. Agregue anticuerpos contra marcadores de superficie específicos de pDC y cDC. Analizar las células mediante citometría de flujo.

Las células positivas para marcadores específicos de pDC y negativas para marcadores específicos de cDC indican un desarrollo exitoso de pDC.

Para analizar los progenitores linfoides comunes, o CLP, mediante citometría de flujo, a continuación, F_c bloquea las células con anti-CD16 / 32 durante uno o dos minutos, seguido de tinción simultánea de las células con el cóctel de anticuerpos apropiado.

Después de 15 minutos con hielo, lave las células en tres mililitros de tampón FACS y vuelva a suspender el gránulo en 300 microlitros de tampón FACS fresco. Luego, filtre la suspensión celular a través de un filtro de 40 micrómetros e inmediatamente clasifique las células en un citómetro de flujo utilizando los filtros y voltajes apropiados, recolectando las células de interés en un tubo de 15 mililitros que contiene 8 mililitros de RPMI completo.

Para generar una población de pDC altamente enriquecida, es crucial clasificar la población correcta de CLP a partir de células de médula ósea recolectadas para el cultivo in vitro con el sistema de alimentación AC-6.

Al final de la clasificación, gire las células hacia abajo y vuelva a suspender el sedimento de la célula CLP con suficiente RPMI completo para obtener una densidad celular de aproximadamente 5 veces 10 a la cuarta célula por mililitro. A continuación, siembre 500 células por pocillo en la placa de 12 pocillos que contiene las células alimentadoras AC-6 y complemente los cocultivos con 100 nanogramos por mililitro de ligando FLT3. Luego, incube las células a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono con monitoreo visual periódico de la célula dendrítica, o desarrollo de DC, bajo un microscopio.

El día 12, coseche las células en el sobrenadante de cocultivo y lave cada pocillo una vez con medio mililitro de medio RPMI completo, agrupando los sobrenadantes y lavados resultantes. Luego, agregue medio mililitro de medio fresco a cada pocillo y use un raspador de células para separar las células adherentes. Combine las celdas separadas con las celdas flotantes y centrifugue la suspensión celular resultante, resuspendiendo el pellet en 50 microlitros de tampón FACS.

Luego, cuente las células y tiñéndolas para la expresión de CD11c, CD11b y B220 después del bloqueo de Fc c, como se acaba de demostrar. Las células cocultivadas se pueden analizar para detectar la presencia de poblaciones de CD convencionales CD11c positivas, CD11b positivas, B220 negativas y plasmocitoides CD11c positivas, CD11b negativas y B220 positivas.