JoVE Encyclopedia of Experiments
Inmunología
0 vistas • 3:47 min • July 8th, 2025
Para provocar una respuesta inmune, las células dendríticas, DC, presentan un antígeno que se muestra con MHC clase II y las moléculas coestimuladoras CD80 y CD86. Según las características de la respuesta inmune, se subdividen en CD inmaduras, maduras y tolerogénicas.
Para generar varios subconjuntos de células dendríticas in vitro, comience con una placa de múltiples pocillos que contenga monocitos humanos, células precursoras inmunes en un medio completo que contenga factores de crecimiento y la citoquina IL-4, una molécula de señalización.
Incube las células durante un período prolongado. Los factores de crecimiento y la IL-4 inducen la proliferación y diferenciación de monocitos en CD inmaduras.
Las CD inmaduras poseen receptores de reconocimiento de patrones, PRR y expresan moléculas coestimuladoras y de clase II de MHC bajas, exhibiendo una capacidad disminuida para provocar una respuesta inmune.
Trate un pozo que contenga CD inmaduras con agentes inmunomoduladores: vitamina D3 y glucocorticoides. Estos agentes inmunomoduladores regulan a la baja la expresión de moléculas coestimuladoras y de clase II del MHC. Esto conduce a la diferenciación en CD tolerogénicas, células inmunorreguladoras que previenen respuestas inmunitarias exageradas o indeseables.
Trate otro pocillo que contenga CD inmaduras con lipopolisacárido, LPS, un antígeno. El LPS interactúa con el receptor tipo toll-4 de las células, un PRR, inicia una cascada de señalización y las diferencia en células maduras. Estas células expresan moléculas coestimuladoras y PRR de clase II de alto MHC, eficientes para el procesamiento y la presentación de antígenos.
Observe los pocillos tratados diferencialmente para obtener características morfológicas distintas que representen los subtipos de células dendríticas.
Siembra cuatro juegos de monocitos CD14+ en una concentración de 0,3 a 0,5 x 106 por mililitro de medio de cultivo celular de IL-4 en placas de seis pocillos. Incubar las células en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados Celsius con 5% de CO2. El día 4, retire 850 microlitros de medio del cultivo y centrifugue.
Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento en 1 mililitro de medio de cultivo celular. Vuelva a agregar la mezcla de células al cultivo. El día 5, agregue 1 microlitro de caldo de vitamina D3 y 1 microlitro de caldo de dexametasona por mililitro de medio a dos de los conjuntos para generar moDC tolerogénicos.
El día 6, agregue 200 nanogramos por mililitro de GM-CSF y 200 nanogramos por mililitro de IL-4 a todos los conjuntos. Agregue 1 microgramo por mililitro de LPS a uno de los conjuntos tratados solo con GM-CSF e IL-4 para generar moDC maduros.
Agregue 1 microgramo por mililitro de LPS a un conjunto de modos tolerogénicos moDC para generar moDC tolerogénicos de LPS. Finalmente, el día 7, coseche los diferentes tipos de moDC enjuagando la placa de cultivo con PBS-EDTA.