Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 3:01 min. • July 8th, 2025
Según sus receptores de superficie celular, las células B circulantes humanas se clasifican como células B vírgenes CD19 positivas, células B de memoria CD19 y CD27 positivas, y células plasmáticas plasmablastos CD19, CD27 y CD38 positivas.
Para clasificar estas poblaciones celulares, tome una suspensión purificada de células B. Incubar con anticuerpos de inmunoglobulina G humana. Los anticuerpos bloquean los receptores Fc de las células B, evitando la unión de anticuerpos inespecíficos.
Agregue anticuerpos marcados con fluorescencia dirigidos a CD19, CD27 y CD38.
Los anticuerpos anti-CD19 se unen a los receptores CD19 que se expresan de forma ubicua en las células B.
Los anticuerpos anti-CD27 se unen a los receptores CD27 expresados en las células B de memoria y las células plasmáticas de plasmablastto.
Los anticuerpos anti-CD38 se unen a los receptores CD38 expresados en las células plasmáticas del plasmablastto.
Agregue un tinte fluorescente de unión al ADN como marcador de células muertas.
Las células muertas exhiben una pérdida de integridad de la membrana, lo que permite la entrada celular del colorante y la unión al ADN bicatenario; las células vivas permanecen sin teñir.
Centrifugar para eliminar anticuerpos y colorantes no unidos y resuspender las células en tampón FACS. Filtrar las células a través de un colador para obtener una suspensión homogénea y eliminar grumos.
Con un citómetro de flujo, separe las células muertas de las vivas. Dentro de las células vivas, la expresión de CD19, CD27 y CD38 distingue las células B vírgenes, las células B de memoria y las células plasmáticas plasmablast del plasmablasto.
Después de realizar el bloqueo inespecífico, agregue 1 microgramo de cada anticuerpo de selección por 1 x 106 células al tubo con una mezcla suave para una incubación de 30 minutos en hielo. Durante los últimos cinco minutos de incubación, agregue 5 microlitros de 7-AAD a las células. Luego, agregue 2 mililitros de PBS fresco a las celdas y haga un vórtice antes de centrifugar.
Vuelva a suspender el gránulo en un tampón de clasificación nuevo a una concentración de1 a 5 x 10 7 células por mililitro y filtre las células a través de un colador de células de 40 micras en un nuevo tubo de poliestireno de 5 mililitros. Luego, clasifique las células por citometría de flujo en tres tubos de 15 mililitros que contienen 5 mililitros de medio RPMI fresco para recolectar las células B vírgenes, las células B de memoria y las células plasmáticas del plasmablasto.