Evaluación funcional de linfocitos B secretores de anticuerpos mediante el ensayo ELISpot

células B secretoras de anticuerpos, o ASC, son células B diferenciadas que secretan isotipos de anticuerpos, incluidas IgG e IgM, para garantizar la protección contra patógenos.

Para realizar una evaluación funcional de las ASC in vitro, comience con el ensayo de punto inmunoabsorbente ligado a enzimas. Tome una placa ELISpot que contenga una membrana de fluoruro de polivinilideno activado en la base.

Incubar los pocillos con fragmentos de anticuerpos policlonales que contengan exclusivamente regiones Fab sin la región Fc del anticuerpo. Cada región Fab tiene un sitio de unión para isotipos de anticuerpos específicos: IgG o IgM, lo que permite la identificación de ambos isotipos.

Durante la incubación, los fragmentos de anticuerpos se adhieren a la membrana, lo que lleva a la inmovilización.

Superponga los pocillos con soluciones de bloqueo para evitar la unión no específica. Siembre la placa con células B secretoras de anticuerpos activados e incube. Las ASC secretan diferentes isotipos, incluidos IgG e IgM, que se unen a los fragmentos de anticuerpos unidos a la membrana.

Lave la placa con un tampón para eliminar los anticuerpos secretados no unidos. Tratar algunos pocillos con anticuerpos de detección conjugados enzimáticamente para IgM y otros con anticuerpos de detección para IgG, e incubar.

Los anticuerpos de detección se unen a sus respectivos isotipos, formando inmunocomplejos.

Agregue sustratos colorimétricos a todos los pocillos, que interactúan con las enzimas y producen manchas de color púrpura en la membrana. Agregue una solución de parada para detener la reacción.

La mancha de color producida en cada pocillo indica la presencia del isotipo del anticuerpo específico, correlacionándose con la actividad secretora de las células B.

Cuando se hayan recolectado todas las células, siembre los subconjuntos en pocillos individuales de una placa de cultivo celular de 12 pocillos a una concentración de 1 a 10 x 10 5 células por mililitro en medio RPMI fresco. A continuación, active las células B con 5 microgramos de CpG (ODN 2006) por 1 x 10⁶ células por mililitro por pocillo en la incubadora de cultivo celular durante cinco días.

Al final de la activación, agregue 30 microlitros de etanol al 35% en agua destilada a cada pocillo de las placas ELISpot durante 30 segundos. Luego, reemplace el etanol en cada pocillo con 150 microlitros de agua doble destilada esterilizada en autoclave e incube las placas a temperatura ambiente durante 5 minutos para eliminar el etanol residual. Realice un lavado de PBS, seguido de la adición de 50 microlitros del fragmento policlonal F (ab') 2 de Ig antihumana a cada pocillo.

Lave los platos dos veces con PBS, como se acaba de demostrar. Bloquear la unión inespecífica en cada pocillo con 200 microlitros de PBS fresco con BSA durante dos horas a temperatura ambiente. Después de otra serie de lavado de PBS, incube los pocillos en 100 microlitros de medio RPMI 1640 fresco a 37 grados centígrados. Luego, reemplace el medio en cada pozo ELISpot con la cantidad adecuada de células B activadas.

Lleve el volumen final de cada pocillo a 150 microlitros con medio RPMI fresco. Luego, regrese la placa ELISpot a la incubadora de cultivos celulares durante 8 a 14 horas. Al final del período de incubación, deseche el medio y lave los pocillos con 200 microlitros de PBS más Tween 20 durante cinco lavados de 3 minutos.

Después del último lavado, agregue los anticuerpos de detección apropiados a sus pocillos correspondientes e incube las placas durante dos horas en la oscuridad. Después de otra serie de lavado de PBS, agregue 50 microlitros de sustrato BCIP / NBT a cada pocillo durante 5 a 15 minutos a temperatura ambiente.

Cuando aparezcan manchas moradas, detenga la reacción con 100 microlitros de agua doble destilada por pocillo y enjuague la placa con agua corriente del grifo. Luego, seque al aire las membranas ELISpot protegidas de la luz.