Cultivo de células T activadas a partir de células mononucleares de sangre periférica humana

Múltiples interacciones receptor-ligando de la superficie celular entre las células T vírgenes y las células presentadoras de antígenos, APC, provocan la activación y proliferación de células T.

Los dos eventos principales en este proceso involucran el reconocimiento del antígeno expresado por APC por el complejo receptor de células T CD3, seguido de la interacción entre el ligando B7 expresado por APC y el receptor de células T CD28.

Para estudiar la activación y proliferación de células T in vitro, tome células mononucleares de sangre periférica humana, PBMC, suspendidas en un medio de cultivo adecuado. Agregue perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 y divida las células en dos tubos cónicos.

Agregue la citocina interleucina-2, IL-2, al primer tubo e interleucina-15, IL-15, al otro. Transfiera las células a una placa de pocillos múltiples. Incubar.

Los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 de las perlas se unen al complejo receptor de células T CD3 y al receptor CD28 expresados en las células T, respectivamente, causando la activación y proliferación de células T.

Con IL-2, la citocina se une a su receptor en la superficie de las células T activadas, lo que lleva a su diferenciación y proliferación en células T efectoras. Por el contrario, la IL-15 impulsa principalmente la diferenciación y proliferación de células T en células T de memoria.

Vuelva a suspender y transfiera la mitad de las células a nuevos pocillos para permitir el crecimiento celular. Agregue medio nuevo que contenga IL-2 o IL-15 para mantener las poblaciones de células T diferenciadas por citocinas para su análisis posterior.

Para comenzar, lave las perlas CD3 / CD28 transfiriendo 12,5 microlitros de perlas por millón de células a un tubo de microcentrífuga y agregando 12,5 microlitros de PBS por 12,5 microlitros de las perlas en el tubo. Luego, coloque el tubo de microcentrífuga en un imán adecuado durante 1 minuto, deseche el tampón y vuelva a suspender las perlas en el volumen original del medio de células T.

A continuación, agregue 12,5 microlitros de perlas por millón de células en una proporción de 1 a 2 perlas por células, y divida las células en dos condiciones con alrededor de 5 millones de células en cada una. Luego, agregue el volumen correcto de citocinas a cada condición y transfiera las células a placas de pocillos múltiples. Incube las células durante tres días a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.

Después de tres días de incubación, prepare un medio de células T fresco con el doble de concentración de citocinas. Vuelva a suspender y dividir las celdas transfiriendo la mitad del volumen de cada pocillo a un nuevo pocillo. Luego, agregue el mismo volumen de medio de células T recién preparado a cada pocillo.