Cultivo de células T activadas a partir de células mononucleares de sangre periférica humana
JoVE Encyclopedia of Experiments
Inmunología
0 vistas • 3:25 min • July 8th, 2025
Múltiples interacciones receptor-ligando de la superficie celular entre las células T vírgenes y las células presentadoras de antígenos, APC, provocan la activación y proliferación de células T.
Los dos eventos principales en este proceso involucran el reconocimiento del antígeno expresado por APC por el complejo receptor de células T CD3, seguido de la interacción entre el ligando B7 expresado por APC y el receptor de células T CD28.
Para estudiar la activación y proliferación de células T in vitro, tome células mononucleares de sangre periférica humana, PBMC, suspendidas en un medio de cultivo adecuado. Agregue perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 y divida las células en dos tubos cónicos.
Agregue la citocina interleucina-2, IL-2, al primer tubo e interleucina-15, IL-15, al otro. Transfiera las células a una placa de pocillos múltiples. Incubar.
Los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 de las perlas se unen al complejo receptor de células T CD3 y al receptor CD28 expresados en las células T, respectivamente, causando la activación y proliferación de células T.
Con IL-2, la citocina se une a su receptor en la superficie de las células T activadas, lo que lleva a su diferenciación y proliferación en células T efectoras. Por el contrario, la IL-15 impulsa principalmente la diferenciación y proliferación de células T en células T de memoria.
Vuelva a suspender y transfiera la mitad de las células a nuevos pocillos para permitir el crecimiento celular. Agregue medio nuevo que contenga IL-2 o IL-15 para mantener las poblaciones de células T diferenciadas por citocinas para su análisis posterior.
Para comenzar, lave las perlas CD3 / CD28 transfiriendo 12,5 microlitros de perlas por millón de células a un tubo de microcentrífuga y agregando 12,5 microlitros de PBS por 12,5 microlitros de las perlas en el tubo. Luego, coloque el tubo de microcentrífuga en un imán adecuado durante 1 minuto, deseche el tampón y vuelva a suspender las perlas en el volumen original del medio de células T.
A continuación, agregue 12,5 microlitros de perlas por millón de células en una proporción de 1 a 2 perlas por células, y divida las células en dos condiciones con alrededor de 5 millones de células en cada una. Luego, agregue el volumen correcto de citocinas a cada condición y transfiera las células a placas de pocillos múltiples. Incube las células durante tres días a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
Después de tres días de incubación, prepare un medio de células T fresco con el doble de concentración de citocinas. Vuelva a suspender y dividir las celdas transfiriendo la mitad del volumen de cada pocillo a un nuevo pocillo. Luego, agregue el mismo volumen de medio de células T recién preparado a cada pocillo.
Descripción general
Este estudio investiga la activación y proliferación de linfocitos T mediante interacciones receptor-ligando con células presentadoras de antígenos (APC). La metodología consiste en cultivar células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) y utilizar anticuerpos y citocinas específicos para promover respuestas de linfocitos T.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Inmunología
- Biología de las células T
- Técnicas de cultivo celular
Antecedentes
- Los linfocitos T naïve requieren activación para proliferar y diferenciarse.
- El complejo del receptor de células T CD3 y el receptor CD28 desempeñan funciones cruciales en la activación de los linfocitos T.
- Citocinas como IL-2 e IL-15 influyen en el destino de los linfocitos T.
- Comprender estos procesos es fundamental para la investigación inmunológica y las terapias.
Objetivo del estudio
- Elucidar los mecanismos de activación y proliferación de linfocitos T.
- Comparar los efectos de la IL-2 y la IL-15 sobre la diferenciación de linfocitos T.
- Establecer un modelo in vitro confiable para estudiar las respuestas de los linfocitos T.
Métodos Utilizados
- Aislamiento de PBMC a partir de sangre humana.
- Recubrimiento de microesferas magnéticas con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28.
- Cultivo de linfocitos T con IL-2 o IL-15 en placas de múltiples pocillos.
- Incubación en condiciones controladas para favorecer el crecimiento celular.
Resultados principales
- Se logró la activación y proliferación exitosas de los linfocitos T.
- La IL-2 promovió la diferenciación en linfocitos T efector.
- La IL-15 impulsó principalmente la formación de linfocitos T de memoria.
- El crecimiento celular se mantuvo mediante la suplementación con citocinas.
Conclusiones
- El estudio proporciona información sobre los mecanismos de activación de los linfocitos T.
- Diferentes citocinas tienen funciones distintas en la diferenciación de los linfocitos T.
- Este modelo in vitro puede utilizarse para estudios inmunológicos adicionales.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La activación y diferenciación ex vivo robustas de linfocitos T humanos a partir de PBMC es fundamental para el descubrimiento de fármacos impulsado por la inmunología y la investigación traslacional. Este protocolo permite la generación estandarizada de poblaciones de linfocitos T efectoras y de memoria, lo que respalda la confianza predictiva en la validación inicial de dianas y en los cribados funcionales. Los sistemas de cultivo de linfocitos T confiables son cruciales para reducir los riesgos de las estrategias inmunomoduladoras y avanzar en las decisiones de cartera dentro de las líneas de desarrollo de inmunoterapias.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite el análisis de las vías de activación de los linfocitos T y la interacción funcional con el blanco.
- Apoya la reducción de riesgos biológicos al distinguir entre respuestas de linfocitos T efector y de memoria.
- Facilita la confianza predictiva en la selección de blancos inmunomoduladores.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Proporciona poblaciones de linfocitos T validadas y reproducibles para ensayos funcionales posteriores.
- Normaliza las condiciones de activación y diferenciación para permitir la comparabilidad entre ensayos.
- Permite la evaluación cuantitativa de los efectos de compuestos sobre la proliferación y el fenotipo de los linfocitos T.
Investigación Translacional y Preclínica
- Alinea la diferenciación de linfocitos T in vitro con fenotipos inmunitarios relevantes para la enfermedad.
- Apoya la continuidad desde el descubrimiento hasta los estudios inmunológicos preclínicos.
- Reduce los riesgos en el avance traslacional mediante la modelización de la biología de los linfocitos T efector y de memoria.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este protocolo de cultivo de linfocitos T se integra en la fase temprana del continuo desde el descubrimiento hasta la preclínica, permitiendo la comprobación de hipótesis, el cribado y la modelización traslacional de las respuestas inmunitarias.
- Biología del Descubrimiento: Apoya estudios mecanicistas de la activación de linfocitos T y la diferenciación inducida por citoquinas.
- Selección: Proporciona linfocitos T diferenciados por citoquinas, reproducibles, para la evaluación funcional de compuestos.
- Análisis: Permite la medición cuantitativa de la proliferación de linfocitos T y los cambios fenotípicos.
- Investigación Traducional: Modela respuestas de linfocitos T efector y de memoria relevantes para el desarrollo de inmunoterapias.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma estandarizada para ensayos basados en células inmunitarias repetidos en múltiples programas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de dianas inmunitarias y en los cribados funcionales.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y escalabilidad de los ensayos basados en linfocitos T.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción de activos inmunomoduladores al reducir la ambigüedad biológica.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de programas dirigidos al sistema inmunitario.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el aislamiento de PBMC humanos y en técnicas de cultivo de linfocitos T.
- Necesita acceso a reactivos de activación basados en microesferas magnéticas y suplementación con citocinas.
- Exige una estandarización entre equipos de los protocolos de activación y diferenciación.
- Puede requerir adaptación para distintas fuentes de donantes o modelos de enfermedad.
- Depende de la calidad constante de las citocinas y del manejo adecuado de las células para garantizar la reproducibilidad.
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Última actualización: 29 agosto 2026