Reconocimiento de marcadores CD de células asesinas inducidas por citocinas humanas mediante citometría de flujo

Las células asesinas inducidas por citoquinas, CIK, son poblaciones heterogéneas de células inmunitarias generadas ex vivo a partir de cultivos de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) estimuladas con citocinas específicas y anticuerpos monoclonales. Las células CIK comprenden poblaciones celulares, incluidas las células T NK CD3 + CD56 +, las células T CD3 + CD56 - y las células NK CD3-CD56 +.

Para determinar la proporción de células CIK, comience con tubos que contengan una suspensión de células CIK derivada de PBMC. Agregue anticuerpos anti-CD3 y anti-CD56 conjugados a diferentes fluoróforos y su mezcla a los tubos designados. Agregue anticuerpos de control de isotipo conjugados con fluoróforos similares como anticuerpos específicos en otros tubos.

Los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD56 marcados con fluorescencia reconocen y se unen a CD3 y CD56 expresados en poblaciones de células CIK, respectivamente. Los anticuerpos de control de isotipos carecen de especificidad del antígeno diana, lo que facilita las mediciones de señales de fondo no específicas.

Pipetee las células en tubos de fondo redondo con tapas de filtro celular, que ayudan a eliminar los agregados celulares. Cargue los tubos en un carrusel de citómetro de flujo. Durante la ejecución, cada célula pasa a través del canal y se encuentra con los rayos láser, dispersando la luz.

Un detector mide la intensidad de la luz dispersa hacia adelante, indicativa del tamaño de la célula; otro mide la intensidad de la luz dispersada lateral perpendicular al rayo láser, lo que sugiere granularidad celular. En conjunto, esta información ayuda a identificar la población de células inmunitarias.

Simultáneamente, los rayos láser de longitudes de onda de excitación específicas excitan los anticuerpos conjugados con fluoróforos en las células, causando emisiones de señales fluorescentes que se detectan.

El análisis de intensidades fluorescentes específicas en las células determina la proporción de subpoblaciones de células CIK.

Comience este procedimiento con la preparación de células CIK, como se describe en el protocolo de texto. Luego, lave las células CIK con 10 mililitros de PBS estéril. Centrifugar durante 10 minutos a 300 veces g y de 18 a 20 grados centígrados. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células con 5 mililitros de PBS. Cuente el número de células y pruebe la viabilidad celular utilizando el ensayo de exclusión de azul de tripano.

Alícuotas de las células CIK en seis tubos estériles de 1,5 mililitros a una densidad de aproximadamente 0,5 a 1 millón de células por mililitro de PBS. Etiquete y trate las células, como se detalla en el protocolo de texto. Mezcle suavemente las células CIK con los anticuerpos pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo al menos tres veces con una pipeta estéril de 1 mililitro. Incube las células durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.

Centrifugar los tubos durante 10 minutos a 300 veces g y de 18 a 20 grados centígrados. Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento celular con 1 mililitro de PBS. Luego, pipetea suavemente las células hacia arriba y hacia abajo al menos tres veces con una pipeta estéril de 1 mililitro. Transfiera la suspensión celular a un tubo estéril de poliestireno de fondo redondo de 5 mililitros con una tapa de filtro celular pipeteando suavemente a través de la tapa. Luego, coloque los tubos en el carrusel en orden.

Abra el software de análisis de citometría de flujo y cree una carpeta experimental. Luego, haga clic en el botón "Nueva muestra" para agregar una muestra y un tubo al experimento. Asigne un nombre a las válvulas como se indica en el protocolo de texto.

Para crear un sistema de dispersión para las poblaciones de células CIK, primero, seleccione el tubo 1 y haga clic en el botón Diagrama de puntos para crear un gráfico FSC-A/SSC-A. Dibuje una puerta rectangular sobre toda la población de células con un umbral FSC-A superior a 5.000 para excluir los restos celulares.

Seleccione el parámetro FSC-A/FSC-H para el nuevo diagrama de puntos y dibuje una puerta de polígono alrededor de todas las celdas individuales. Seleccione el parámetro de recuento frente a conjugado con FITC (CD3) y recuento frente a conjugado con APC (CD56) para el nuevo gráfico de histograma. Seleccione el parámetro conjugado con FITC (CD3) versus conjugado con APC (CD56) para el nuevo diagrama de puntos y dibuje una puerta de cuatro cuadrantes para definir las cuatro subpoblaciones.

Registre los datos de 20,000 células individuales en cada muestra. Haga clic en el botón "Cargar muestra" para analizar primero la muestra de control en blanco. Identifique toda la población de células CIK utilizando los parámetros de los canales CD56 y CD3. Abra los archivos que contienen los valores estadísticos de la muestra individual para analizar las poblaciones de células CIK y vuelva a imprimirlos en archivos de análisis.