Ensayo para la identificación de la secreción de interferón gamma en órganos linfoides murinos

El interferón gamma, o IFN-γ, una citocina secretada por los linfocitos T y las células asesinas naturales o células NK, media la respuesta inmunitaria contra los patógenos.

Para estudiar la producción in situ de IFN-γ, tome un ratón trasplantado con células T marcadas con fluorescencia diseñadas para expresar un receptor que reconoce la ovoalbúmina, un antígeno modelo.

Tome una suspensión de bacterias patógenas, modificadas genéticamente para expresar ovoalbúmina, e inyéctela por vía intravenosa en el ratón, causando una infección sistémica. Las bacterias circulantes llegan al bazo, un órgano linfoide secundario, que ayuda a la eliminación de patógenos al facilitar la interacción con las células inmunitarias.

Las células presentadoras de antígenos engullen a las bacterias y muestran el antígeno. Las células T se unen al antígeno a través de su receptor, se activan y producen IFN-γ.

Las células de macrófagos, infectadas con la bacteria, liberan mediadores inmunológicos y regulan al alza los ligandos activadores en su superficie. Al interactuar con estas señales, las células NK se activan y producen IFN-γ.

Inyectar un inhibidor del transporte de proteínas intracelulares para restringir la secreción de IFN-γ, provocando su acumulación intracelular.

Cosecha el bazo del ratón. Fije el tejido y congélelo para ayudar en la sección. Con un criomicrótomo, genere secciones delgadas de tejido y colóquelas en portaobjetos de vidrio. Agregue anticuerpos específicos de células NK, que se unen a los marcadores de superficie, y anticuerpos específicos de IFN-γ, que tiñen el IFN-γ intracelular. Estos anticuerpos están marcados con diferentes fluoróforos.

Coloque el portaobjetos bajo un microscopio de fluorescencia para detectar γ de IFN dentro de las células NK y las células T.

Deseche la solución fijadora y agregue 5 mililitros de PBS durante 5 minutos a temperatura ambiente, bajo agitación suave. Luego, reemplace el PBS con 5 mililitros de sacarosa al 30% e incube durante 12 a 24 horas para mantener la morfología del tejido. Ahora, el órgano se hunde en el fondo de la placa.

Para congelar la muestra, coloque hielo seco en un recipiente grande y coloque un recipiente más pequeño dentro, que contenga alrededor de 50 mililitros de metanol puro y algunos trozos de hielo seco. Seque suavemente el bazo con una toallita sin pelusa. Gotee una gota de compuesto OCT en el fondo del molde base y coloque el bazo dentro del molde. Tenga cuidado de no producir burbujas.

Agregue aproximadamente 1 mililitro de OCT sobre el bazo. Con unas pinzas, deposite el molde base sobre la superficie del metanol en el baño de hielo seco, asegurándose de que el metanol no toque la OCT. La OCT se espesará y se volverá blanca cuando se congele. Recuerde congelar el tejido lo más rápido posible para minimizar los artefactos.

En un criomicrótomo, ajuste a la temperatura de menos 21 grados centígrados. Secciona el tejido hasta el grosor deseado de alrededor de 10 micrómetros. Use un cepillo para recolectar secciones en portaobjetos de microscopio de vidrio e inspeccione visualmente. Deje que las secciones alcancen la temperatura ambiente.

Dibuje un círculo con un bloqueador de líquidos, por ejemplo, un bolígrafo PAP, alrededor de la sección de tejido fuera de la OCT. Una vez que el tejido se haya secado, rehidrate la muestra goteando 100 microlitros de PBS en la sección de tejido durante 5 minutos. Luego, retire el PBS de la sección por aspiración y agregue 100 microlitros de solución de bloqueo por sección de muestra. Incube en una cámara húmeda cubierta durante un mínimo de una hora a temperatura ambiente.

Para teñir con anticuerpos primarios, reemplace la solución de bloqueo con la mezcla de anticuerpos primarios preparada para cada muestra. Incubar durante cuatro horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 grados centígrados en una cámara húmeda cubierta, antes de lavar según el manuscrito.

Ahora, diluya los anticuerpos secundarios de interés a una concentración óptima, generalmente 2,5 microgramos por mililitro en la solución de bloqueo. Retire la solución de lavado final de la sección, agregue la mezcla de anticuerpos secundarios preparada encima de la sección e incube durante una a cuatro horas a temperatura ambiente en una cámara húmeda cubierta.

Después del lavado con tampón de lavado según el manuscrito, retire la solución de lavado y realice un lavado final con PBS. Aspire la solución salina tamponada con fosfato y deje que el PBS restante se evapore sin que la sección se seque por completo.

Dibuja un círculo alrededor de la sección en la parte posterior de la diapositiva. Luego, coloque una gota del medio de montaje encima de la muestra, asegurándose de que el medio cubra toda la sección, y coloque con cuidado un cubreobjetos en la parte superior. Deje que las muestras polimericen durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad.

Por la mañana, coloque el portaobjetos bajo un microscopio de escaneo láser espectral invertido. Ajuste los objetivos a 10x/NA 0,40 o 60x/NA 1,4 para el análisis de la localización subcelular de las citocinas.