Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 4:25 min. • July 8th, 2025
Los túbulos seminíferos de los testículos contienen células de Sertoli, que nutren las células germinales. Las células de Sertoli están conectadas a través de uniones estrechas y están firmemente unidas a la matriz basal rica en ácido hialurónico. Esta disposición de las células de Sertoli regula la entrada de células inmunitarias en el túbulo y protege a las células germinales en desarrollo de la degradación.
Para aislar las células de Sertoli, comience con un tubo que contenga túbulos seminíferos parcialmente digeridos derivados de testículos de ratón. Estos túbulos carecen de células peritubulares, células de músculo liso que rodean los túbulos seminíferos.
Trate los túbulos con un cóctel de enzimas que contenga hialuronidasa, esencial para la hidrólisis del ácido hialurónico, y ADNasa.
Las hialuronidasas ingresan a los túbulos y escinden el ácido hialurónico, un polisacárido basal, iniciando el desprendimiento de células de Sertoli de la matriz basal y liberando células germinales en la solución. La DNasa digiere cualquier contaminante de ADN de la solución, evitando la agregación celular.
Lave los túbulos digeridos enzimáticamente con un tampón, eliminando las enzimas residuales, los fragmentos celulares y las células germinales. Vuelva a suspender los túbulos digeridos y cargue la suspensión en un conjunto de aguja y jeringa.
Pase la solución repetidamente para crear un cizallamiento hidrodinámico e interrumpir las uniones estrechas de las células de Sertoli, liberándolas como células individuales junto con las células germinales remanentes.
Filtrar la suspensión celular, eliminando los restos celulares y obteniendo una suspensión unicelular. Centrifugar el filtrado para peletizar las células.
Vuelva a suspender las células en un medio de crecimiento sin suero para la expansión selectiva de las células de Sertoli.
Para aislar las células de Sertoli, use una nueva pipeta de 25 mililitros para resuspender completamente los túbulos sedimentados en 25 mililitros de PBS. Después de dejar que los túbulos se asienten durante otros 12 minutos, use la misma pipeta para lavar los túbulos tres veces más de la misma manera. Luego, transfiera los túbulos a una nueva botella con tapa de rosca de 100 mililitros y agregue la solución de hialuronidasa-DNasa-I. Además, digiera los túbulos en un baño de agua agitada a 32 grados centígrados durante cinco minutos.
Compruebe una alícuota de la suspensión mediante inspección con microscopio óptico con un aumento de 100x. Los túbulos cortos, los agregados tubulares y las células liberadas deben ser visibles. Deje que los agregados tubulares se asienten durante 10 minutos. A continuación, utilice una pipeta nueva de 25 mililitros para eliminar el sobrenadante y lave los áridos cuatro veces en 25ml de PBS, con 10 minutos de sedimentación entre cada lavado.
La población contaminante de PTC se habrá reducido. Después del último lavado, agregue 20 ml de medio RPMI 1640 a las celdas y pase la suspensión a través de una aguja de 18G montada en una jeringa de 20 mililitros 10 veces. A continuación, confirme rápidamente que todos los agregados se han disociado y filtre la suspensión celular a través de un filtro celular de 70 micras para obtener una suspensión unicelular pura.
Gire el filtrado hacia abajo, usando la pipeta de 25 mililitros para aspirar cuidadosamente el sobrenadante. A continuación, vuelva a suspender las células de Sertoli aisladas en 40 ml de medio RPMI 1640 sin suero. Luego, cuente el número de células viables por exclusión de tripano-azul y ajuste la concentración celular a 3 x 106 células por mililitro. Finalmente, alimente 1 mililitro de células por pocillo en una placa de seis pocillos.