Aislamiento selectivo de células T CD4⁺ Vδ1⁺ γδ de células mononucleares de sangre periférica humana

Las células T γδ expresan receptores de células T, TCR, que comprenden cadenas gamma y delta con dominios variables y constantes.

Las células T CD4+ Vδ1+, una subpoblación de células T γδ, coexpresan la cadena variable Vδ1 y el correceptor CD4. Estas células migran a los tejidos inflamados y se transdiferencian en células T αβ CD4+ o CD8+ funcionalmente maduras, mediando una respuesta inmunitaria.

Para aislar las células T CD4+ Vδ1+ de las células mononucleares de sangre periférica humana, PBMC, resuspender las células en un tampón. Utilice un reactivo bloqueador de Fc para bloquear los receptores Fc de la superficie celular y evitar la unión de anticuerpos no específicos.

Agregue anticuerpos anti-Vδ1 conjugados con el fluoróforo FITC, que se unen a los antígenos Vδ1 de las células T γδ. Incubar con microperlas magnéticas acopladas a anticuerpos anti-FITC, que se adhieren al colorante FITC en los anticuerpos unidos a células T Vδ1.

Pase la mezcla a través de una columna magnética para atraer las células T Vδ1+ unidas a perlas; las células T Vδ1- permanecen libres y posteriormente se eliminan. Enjuague con fuerza la columna empujando el tampón a través de ella para separar las células T Vδ1+.

Incubar las células con perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos anti-CD4, que se unen al correceptor CD4 de las células. Coloque el tubo en un imán para atraer las células T CD4+ Vδ1+ unidas a perlas; las células T CD4- Vδ1+ permanecen libres.

Vuelva a suspender las células T CD4+ Vδ1+ en un medio. Agregue un reactivo de desprendimiento de perlas para liberar las perlas de las celdas. Vuelva a colocar el tubo en el imán para separar las cuentas.

Recoja el sobrenadante de células CD4+ Vδ1+ para su posterior análisis.

Antes de comenzar el aislamiento de células T Vδ1, use una alícuota de 1 x 10⁶ de la PBMC para evaluar la frecuencia de células T positivas para Vδ1CD4 en la muestra del donante mediante citometría de flujo. Luego, gire hacia abajo el resto de los linfocitos y vuelva a suspender el gránulo en 60 microlitros de tampón MACS por 1 x 10 7 células.

A continuación, bloquee las células en 20 microlitros de reactivo bloqueador de Fc por 1 x 10⁷ células, seguido de la adición de 10 microlitros de anticuerpo Vδ1 humano conjugado con FITC por 1 x 10⁷ células durante 12 minutos a 4 grados centígrados en la oscuridad. Al final de la incubación, lave las células en 14 mililitros de tampón MACS.

Vuelva a suspender el gránulo en 80 microlitros de tampón MACS por 1 x 10⁷ celdas y agregue 20 microlitros de microperlas anti-FITC por 1 x 10⁷ celdas con mezcla. Después de 15 minutos en la oscuridad a 4 grados centígrados, lave las células en 10 mililitros de tampón MACS fresco.

Durante la centrifugación, equilibre una columna magnética preenfriada con 500 microlitros de tampón MACS. Luego, vuelva a suspender las celdas en 500 microlitros de tampón MACS y agréguelas con cuidado a la parte superior de la columna.

Enjuague la columna con tres lavados tampón MACS de 500 microlitros. Luego, retire la columna del imán y use un émbolo para enjuagar rápidamente las células positivas para Vδ1 con 1 mililitro de tampón MACS en un tubo cónico de 15 mililitros.

Después de pasar las células a través de una segunda columna, divida en vórtice 25 microlitros de perlas de CD4 durante 30 segundos. Luego, transfiera las perlas a un tubo de reacción de 1,5 mililitros, que contenga 1 mililitro de tampón MACS, y coloque el tubo en un imán.

Después de 1 minuto, use una pipeta de 200 microlitros para aspirar cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender las perlas en 25 microlitros de tampón MACS. A continuación, gire hacia abajo las células positivas para Vδ1 aisladas y vuelva a suspender el sedimento en 500 microlitros de tampón MACS. Mezcle las células vigorosamente con las perlas. Luego, después de 20 minutos a 4 grados centígrados, con inclinación constante, vuelva a colocar el tubo en el imán.

Para evitar la pérdida de volumen de muestra y minimizar la presencia de células CD4 negativas contaminantes, es esencial pipetear cualquier tampón restante desde el interior de la tapa de nuevo en el vial.

Después de dos minutos, use una pipeta de 200 microlitros para transferir el sobrenadante que contiene células CD4 negativas Vδ1 positivas a un tubo nuevo. Luego, retire las células CD4 positivas del imán y vuelva a suspenderlas en 500 microlitros de tampón MACS.

Después de retirar las células CD4 negativas dos veces más, como se acaba de demostrar, incube las células CD4 positivas en 100 microlitros de medio de cultivo y 10 microlitros de solución de desprendimiento de perlas a temperatura ambiente durante 45 minutos con inclinación constante. Al final de la incubación, devuelva las células al imán durante 1 minuto y utilice una pipeta de 200 microlitros para transferir el sobrenadante que contiene células CD4 positivas para Vδ1 positivas sin perlas a un nuevo tubo.

Después de quitar las cuentas restantes dos veces más, como se acaba de demostrar, gire las celdas hacia abajo. Luego, vuelva a suspender las células CD4 positivas para Vδ1 en un medio fresco precalentado para su recuento.