Visualización intravital de linfocitos intraepiteliales gamma delta

Los linfocitos intraepiteliales gamma delta, γδ IEL, son células T migratorias especializadas que expresan receptores de células T gamma delta. Estas células se encuentran predominantemente dentro del epitelio intestinal y patrullan el epitelio para limitar la translocación de patógenos a través del intestino.

Para visualizar los γδ IELs dentro de un organismo vivo, comience con un ratón transgénico anestesiado con un intestino delgado parcialmente expuesto. El ratón transgénico está modificado genéticamente para expresar proteínas reporteras, proteínas fluorescentes verdes mejoradas, exclusivamente en γδ IEL, lo que permite su seguimiento.

Usando un electrocauterio, cree una línea de perforación sobre el intestino delgado expuesto a lo largo de la superficie antimeentérica, evitando el sangrado excesivo.

Haga una incisión longitudinal sobre la línea de perforación para exponer la mucosa intestinal, mostrando múltiples proyecciones en forma de dedos: vellosidades. Cada vellosidad contiene células epiteliales con γδ IEL residentes que sobresalen en la luz intestinal.

Coloque el ratón con la superficie mucosa expuesta directamente en contacto con el tinte fluorescente, impartiendo fluorescencia roja a la luz.

Tome imágenes del ratón bajo un microscopio confocal. Localice una vellosidad e imagen en diferentes planos focales a lo largo del eje z, comenzando desde el epitelio de la punta de las vellosidades. Combine estas secciones ópticas para producir una imagen 3D.

Las imágenes intravitales muestran el movimiento dinámico de los BIT γδ de fluorescencia verde a lo largo de la membrana basal de la célula epitelial cerca de la luz roja.

Colocando dos pares de fórceps a cada lado del mesenterio subyacente entre los vasos sanguíneos, frote suavemente las puntas de los fórceps para crear un orificio en la membrana. Con unas pinzas angulares y una aguja curva de punta cónica unida a una sutura de 5 centímetros, penetre un lado del peritoneo a través del orificio de la membrana y hacia arriba a través del otro lado del revestimiento peritoneal, colocando una sutura en la parte superior y otra cerca de la parte inferior de la incisión para cerrar la incisión mientras mantiene el asa del intestino exteriorizada.

Para aumentar la probabilidad de éxito, no ate ni rompa ningún vaso sanguíneo mientras coloca la estructura abdominal y limite cualquier manipulación extraña del intestino.

Luego, cierre la piel debajo del asa intestinal de la misma manera, colocando una sutura en el medio de la incisión entre las suturas anteriores en el peritoneo subyacente. Con un electrocauterio, haga una línea de perforación a lo largo del borde antimesentérico e inmediatamente aplique unas gotas de agua en la superficie del intestino para evitar daños tisulares adicionales inducidos por el calor.

Seque con una toallita Kimwipe para eliminar el agua residual. Use tijeras Vannas para cortar una hendidura horizontal de aproximadamente 1,5 centímetros en el borde distal del tejido cauterizado, a lo largo de la línea cauterizada hacia el extremo proximal del segmento de tejido externalizado. Cuando la superficie de la mucosa esté expuesta, cubra el abdomen con un Kimwipe húmedo para mantener el tejido hidratado.

Para imágenes de microscopía confocal de disco giratorio, transporte el ratón al microscopio en un recipiente cubierto. Inicie el software de imágenes, incline el cabezal del microscopio hacia atrás y agregue 150 microlitros de colorante AlexaFluor de flota de 1 micromolar en la solución salina tamponada de Hank en el fondo cubierto de vidrio. Coloque el ratón de modo que la superficie mucosa abierta entre en contacto directo con el cubreobjetos.

Coloque el ratón y el plato en la platina de imagen en una incubadora precalentada. Establezca la intensidad de excitación y el tiempo de exposición para cada láser en no más de 10 a 15 milivatios y de 120 a 150 milisegundos respectivamente, y ajuste el promedio de fotogramas a "2".

Active la función de ganancia de multiplicación de electrones para reducir el ruido de fondo y seleccione la calibración del objetivo 63X para garantizar una medición correcta del tamaño de píxel. Usando el láser de 405 nanómetros y el objetivo de aire de 20x, visualice manualmente los núcleos para localizar un campo de vellosidades que carecen de movimiento o deriva perceptible, evitando áreas de movimiento artifactual debido a la respiración, el peristaltismo o los latidos del corazón.

Usando el escaneo XY, registre la coordenada x-y del campo de interés y cambie al objetivo de inmersión en glicerol 63X. Adquiera una imagen en vivo en el canal de 405 nanómetros durante un máximo de 1 minuto para confirmar que las vellosidades en el campo seleccionado son estables, mientras ajusta el enfoque para encontrar el plano ortogonal justo debajo de la punta vellosa.

Luego, adquiera pilas Z comenzando justo debajo del epitelio de la punta vellosa, aproximadamente de 15 a 20 micrómetros, hasta las vellosidades, hasta que sea difícil resolver los núcleos usando pasos de 1,5 micrómetros. De 3 a 5 minutos después de comenzar la adquisición, confirme la estabilidad de la imagen y la motilidad de las células intraepiteliales gamma-delta, y continúe adquiriendo imágenes durante 30 a 60 minutos para cada campo de vellosidades.