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Las micropartículas celulares son vesículas unidas a la membrana de tamaño submicrónico que encierran biomoléculas liberadas de la membrana plasmática de las células eucariotas que sufren apoptosis.
Para generar micropartículas derivadas de linfocitos T, los LMP in vitro, tome un matraz de cultivo que contenga cultivo de linfocitos T. Agregue actinomicina-D, un antibiótico. Incubar durante un tiempo adecuado.
La actinomicina-D ingresa a los linfocitos y se transloca al núcleo. Se intercala entre pares de bases de ADN específicos, inhibiendo la transcripción. Esto conduce a la detención del ciclo celular y activa la vía apoptótica.
Al inicio de la apoptosis, la caspasa-3 activada escinde y activa la quinasa asociada a rho, ROCK1. ROCK1, a su vez, fosforila sus proteínas diana aguas abajo, lo que provoca la contracción de la actomiosina, lo que provoca la formación de ampollas en la membrana y la posterior liberación de LMP que contienen los componentes citosólicos y nucleares en el medio.
Las células eventualmente sufren apoptosis.
Después de la incubación, transfiera el medio de cultivo a un tubo nuevo. Centrifugar para granular los linfocitos T. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo.
Centrífuga para eliminar los restos de células grandes. Transfiera el sobrenadante que contiene LMP a una botella. Realice ultracentrifugación de alta velocidad para granular los LMP. Vuelva a suspender los LMP en un tampón. Almacenar a bajas temperaturas hasta su posterior análisis.
Para comenzar, cultive las células T CEM en cuatro matraces T175, cada uno con 150 mililitros de medio fresco, e incube a 37 grados Celsius a una densidad de 2 millones de células por mililitro.
Recoja las células de cada matraz por centrifugación a 200 veces g durante 5 minutos y vuelva a suspender 300 veces 10 a las 6 células en un nuevo matraz T175 que contenga 150 mililitros de medio fresco, para mantener la densidad de 2 millones de células por mililitro. Agregue 37,5 microlitros de actinomicina D al medio a una concentración final de 0,5 microgramos por mililitro e incube a 37 grados centígrados durante 24 horas.
Transfiera todo el medio de cultivo a tubos cónicos de 50 mililitros y gire las células a 750 veces g durante 5 minutos. Luego, transfiera el sobrenadante a tubos cónicos de 50 mililitros y centrifugue a 1.500 veces g durante 15 minutos para eliminar los fragmentos de células grandes.
A continuación, transfiera el sobrenadante a una botella de 250 mililitros y ultracentrífuga a 12,000 veces g durante 50 minutos. Luego, deseche el sobrenadante y recoja los gránulos. Use 40 mililitros de PBS estéril para lavar los gránulos enriquecidos con LMP en un tubo de 50 mililitros y centrifugar a 12,000 veces g durante 50 minutos. Repita este paso dos veces.
Recoger el sobrenadante del último lavado para utilizarlo como control del vehículo, con 1 mililitro de PBS. Suspenda los gránulos y transfiéralos a un microtubo estéril de 1,5 mililitros. Alícuotas y almacene los LMP aislados a 80 grados Celsius negativos.