Una técnica in vitro para diferenciar las células T auxiliares productoras de GM-CSF de las células T vírgenes

El factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, GM-CSF, es secretado por células T auxiliares productoras de GM-CSF o células T_HGM. Estas células muestran una baja expresión de otras citocinas específicas de células T auxiliares.

Para comenzar la diferenciación in vitro de las células T_HGM, tome una suspensión de células T auxiliares, aislada del bazo del ratón, que contiene células maduras activadas por antígeno y células vírgenes indiferenciadas.

Agregue anticuerpos marcados con fluorescencia dirigidos a marcadores de superficie característicos de las células vírgenes y maduras. Realice la clasificación de células activadas por fluorescencia para aislar las células T vírgenes.

Coloque las células en un pozo recubierto con anticuerpos que se unen al complejo receptor de células T. Agregue un anticuerpo que se una al receptor coestimulador. La unión sinérgica activa las células.

Agregue interleucina 7, una citocina, que induce la diferenciación en células T_HGM y la producción de GM-CSF. Agregue acetato de miristato de forbol, PMA, un compuesto proinflamatorio, ionomicina, un ionóforo de calcio y un inhibidor del transporte de proteínas.

La PMA ingresa a la célula y activa una proteína quinasa. La ionomicina permeable a la membrana transloca los iones de calcio dentro de la célula, elevando la concentración de calcio intracelular.

La activación de la proteína quinasa y un alto nivel de calcio inician señales que reestimulan las células GM de TH, lo que resulta en una mayor producción de GM-CSF. El inhibidor del transporte de proteínas bloquea la secreción de GM-CSF, lo que ayuda a la detección intracelular.

Realice tinciones de inmunofluorescencia, detecte citocinas intracelulares y analice las células mediante citometría de flujo. La mayoría de las células que muestran altos niveles de GM-CSF pero una baja expresión de otras citocinas indican una diferenciación exitosa en células T_HGM.

Para aislar las células T CD4 positivas, vuelva a suspender el gránulo de glóbulos blancos en 5 mililitros de tampón de aislamiento celular y filtre la suspensión celular a través de un colador de 30 micrómetros en un nuevo tubo de 15 mililitros para eliminar cualquier residuo. Después del recuento, vuelva a suspender las células a 1 x 10⁷ células por 90 microlitros de concentración de tampón y agregue 10 microlitros de perlas magnéticas conjugadas anti-CD4 por 1 x 10⁷ células para una incubación de 15 minutos a 4 grados centígrados, con mezcla cada 5 minutos.

Mientras las células se incuban, coloque una columna de separación en un soporte magnético y humedezca previamente la columna con 2 mililitros de tampón. Luego, lave las celdas con 5 mililitros de tampón y vuelva a suspender el gránulo en 1 mililitro de tampón. Cargue la muestra en la columna y recoja la fracción CD4 negativa en un tubo cónico de 15 mililitros.

Cuando todas las células hayan pasado a través de la columna, lave el depósito tres veces con 1 mililitro de tampón por lavado antes de que se seque. Después del último lavado, transfiera la columna a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros y sumerja la columna con 2 mililitros de tampón de aislamiento celular para expulsar la fracción de perlas positivas. Luego, recolecte las células CD4 positivas por centrifugación.

Para la clasificación celular activada por fluorescencia de las células T vírgenes, vuelva a suspender el sedimento de células CD4 positivas clasificado por perlas en 500 microlitros de tampón y mezcle las células con un cóctel de anticuerpos conjugado con fluorescencia apropiado. Después de 20 a 30 minutos en hielo, protegido de la luz, lave las celdas en 5 mililitros de tampón fresco y vuelva a suspender el gránulo en 500 microlitros de tampón fresco.

Filtre las celdas a través de una malla de nailon y transfiera las celdas a un tubo FACS precodificado con 500 microlitros de tampón. Puerta para seleccionar las poblaciones de células altas con ligando CD4 positivo, CD25 negativo y CD44 con bajo contenido de CD62. Luego, clasifique las fracciones de células T no deseadas CD4 positivas, CD25 negativas, CD-44 bajas, CD-62 altas en un nuevo tubo de centrífuga de 15 mililitros y granular las células T CD4 positivas vírgenes aisladas por centrifugación.

Para la diferenciación de células T auxiliares del factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, o GM-CSF, resuspenda las células T clasificadas a una concentración de 1 x 10 6 células por mililitro en medio RPMI completo que contenga 50 beta-mercaptoetanol micromolar, y aspire el anticuerpo épsilon anti-CD3 de cada pocillo de una placa de 48 pocillos precodificada

Luego, siembre 2.5 x 10⁵ células en cada pocillo junto con IL-7, anti-CD28 y anti-IFN gamma, e incube las células a 37 grados Celsius y 5% de CO₂ durante tres días. En el tercer día de cultivo, use un microscopio para verificar la diferenciación celular y recolecte las células para centrifugarlas.

Vuelva a suspender el gránulo en medio RPMI completo fresco durante dos lavados, resuspendiendo las células en 1 mililitro de medio completo fresco después del segundo lavado para su conteo. Divida las células en tres volúmenes iguales y vuelva a estimular la primera alícuota de células con PMA e ionomicina en presencia de un inhibidor del transporte de proteínas durante 4 a 6 horas.

Al final de la estimulación, recolecte las células para teñirlas con anticuerpos anti-CD4. Después de 30 minutos, fije las células con 200 microlitros de tampón de fijación durante 20 a 60 minutos, seguido de dos lavados en 1 mililitro de tampón de permeabilización por lavado. Luego, tiñe para la expresión de citocinas intracelulares durante 30 minutos en la oscuridad.