JoVE Encyclopedia of Experiments
Inmunología
0 vistas • 4:29 min • July 8th, 2025
Para monitorear el reclutamiento de neutrófilos, células inmunes esenciales que facilitan la eliminación bacteriana, comience con un ratón anestesiado, transgénico e inmunocomprometido con una herida que exponga el tejido conectivo en su espalda.
Los neutrófilos del ratón transgénico expresan una proteína fluorescente verde mejorada, lo que facilita el seguimiento de los neutrófilos. Además, su capacidad deteriorada para matar bacterias hace que el ratón sea más susceptible a las infecciones.
Tomemos un inoculante bacteriano modificado genéticamente que posea bioluminiscencia, características emisoras de luz.
Inyecte el inóculo bacteriano en el sitio de la herida, asegurando su entrega entre el tejido conectivo y la fascia, una capa de tejido fibroso debajo del tejido conectivo. En el lugar de la inyección, las bacterias proliferan y colonizan, causando infección del tejido.
En respuesta a la infección, las células inmunitarias liberan quimiocinas, moléculas de señalización química que atraen a los neutrófilos. Los neutrófilos migran rápidamente a través de la quimiotaxis, el movimiento inducido por sustancias químicas, y se extravasan a través de los vasos sanguíneos hacia el tejido cercano a la infección bacteriana.
Tome imágenes del ratón en busca de señales de bioluminiscencia y fluorescencia, que representan la carga bacteriana y los neutrófilos reclutados, respectivamente.
Con el tiempo, un aumento en las señales de bioluminiscencia y fluorescencia se correlaciona con el aumento de la carga bacteriana y el reclutamiento continuo de neutrófilos en el sitio de la infección.
Para la inoculación de Staph aureus, llene una jeringa de insulina de calibre 28 con 50 microlitros del inoculante bacteriano bioluminiscente preparado y use un dedo para tirar de la dermis del animal herido hacia un lado. Sosteniendo la jeringa casi paralela al tejido, inserte lentamente la jeringa en el tejido hasta que se sienta una disminución repentina de la resistencia, lo que indica una perforación de la fascia.
Con la aguja colocada en el centro de la herida, administre lentamente todo el volumen del inoculante. Confirme que el inoculante forma una burbuja en el centro de la herida con una fuga o dispersión mínima, y retire la jeringa lentamente del animal. Luego, regrese al animal a su jaula con calor y monitoreo, hasta que se recupere por completo.
Después de la herida y la infección, y diariamente durante el experimento, coloque el ratón anestesiado en un generador de imágenes bioluminiscentes y de fluorescencia con la herida lo más plana posible. En el software del generador de imágenes, seleccione Luminiscencia y Fotografía como modos de imagen. El tiempo de exposición debe preajustarse a 1 minuto en binning pequeño, F/stop 1 para luminiscencia, F/stop 8 para fotografía y Open para el filtro de emisión. A continuación, haga clic en Adquirir para grabar la imagen.
Para obtener imágenes de fluorescencia in vivo, seleccione Fluorescencia y Fotografía como modos de imagen. El tiempo de exposición debe preestablecerse en 1 segundo en binning pequeño, F/stop 1 para fluorescencia, F/stop 8 para fotografía y longitudes de onda de excitación y emisión de 465 sobre 30 nanómetros y 520 sobre 20 nanómetros con una alta intensidad de lámpara respectivamente. A continuación, haga clic en Adquirir para grabar la imagen.
Después de obtener ambos conjuntos de imágenes, devuelva al animal a su jaula con monitoreo hasta que se recupere por completo.
Para el análisis de imágenes, abra la imagen que se cuantificará en un programa de software de análisis de imágenes apropiado y coloque la región circular predeterminada de interés en toda el área de la herida, incluida la piel circundante. Haga clic en Medir región de interés y registre los valores del flujo medio de la herida para permitir que se represente el flujo medio de cada señal en función del tiempo.
Para medir la cicatrización de la herida, coloque una región circular de interés sobre el borde de la herida y mida el área de la herida en centímetros cuadrados para permitir trazar el cambio fraccionario desde la línea de base en función del tiempo.