Identificación de inhibidores de la quinasa que modulan la respuesta de los timocitos a señales fuertes de TCR

Comience con células de timocitos de ratones en una placa de pocillos múltiples. Agregue perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28. A un subconjunto de pocillos, agregue una concentración adecuada del inhibidor de la quinasa de prueba. Incubar.

Los anticuerpos se unen a los receptores CD3 y CD28 de la superficie celular en los timocitos doble positivos y los activan, lo que provoca una regulación a la baja de los receptores de células T, TCR y la activación de la proteína quinasa citosólica.

Estas proteínas quinasas activan las vías de señalización aguas abajo, lo que lleva a una mayor expresión de CD69 en la superficie celular y a la activación citosólica de la caspasa-3. La caspasa-3 activada escinde las proteínas celulares esenciales, iniciando la apoptosis de los timocitos.

En las células tratadas con el inhibidor de la quinasa, los inhibidores bloquean las quinasas citosólicas, modulando la expresión de CD69 y la activación de la caspasa-3.

Pipeta en un cóctel de anticuerpos marcado con fluoróforo que se une a los correceptores TCR, CD4 y CD8 de los timocitos y a los receptores CD69. Tratar los timocitos con un tampón para fijarlos y permeabilizarlos.

Incubar con un anticuerpo anti-caspasa-3 marcado con fluoróforo que se une a la caspasa-3 citosólica. Analizar los timocitos mediante citometría de flujo.

Los timocitos de control doblemente positivos expresan los marcadores fluorescentes de la superficie celular CD4, CD8 y CD69 y la caspasa-3 intracelular y muestran una regulación a la baja del TCR. Por el contrario, los timocitos tratados con inhibidores exhiben niveles más bajos de CD69 fluorescente y caspasa-3.

Para comenzar el tratamiento de timocitos con inhibidores de la quinasa, use una pipeta multicanal para agregar 40 microlitros por pocillo de timocitos a una placa de pequeño volumen. Pon el plato en hielo. Luego, pipetee una parte de inhibidores de quinasa, DMSO y dexametasona, y cuatro partes del medio RPMI completo en una placa de 96 pocillos.

Designe ocho pocillos de la placa de pequeño volumen a los controles no tratados, cuatro pocillos a los controles positivos tratados con dexametasona para la muerte celular, agregando la dexametasona diluida a la concentración de 5 micromolares, y cuatro pocillos a los controles tratados con vehículo agregando 0,5 microlitros del DMSO diluido. A continuación, de los pocillos correspondientes de la placa inhibidora, agregue 0,5 microlitros de cada inhibidor diluido a la placa de 96 pocillos.

Para comenzar la estimulación de los timocitos, primero, asegúrese de que las perlas anti-CD3 y CD28 se resuspendan uniformemente. Luego, lave 1 mililitro de las perlas con 2 mililitros del tampón PBS. Coloque el tubo en un soporte magnético para separar las perlas del sobrenadante y aspire la solución. Luego, vuelva a suspender las perlas en 1 mililitro del medio RPMI completo.

Agregue 10 microlitros por pocillo de la suspensión de perlas a cada muestra tratada con inhibidor, las cuatro muestras tratadas con DMSO y cuatro de las 8 muestras no tratadas. Agregue 10 microlitros del RPMI completo a los cuatro pocillos restantes sin tratar.

Use un agitador orbital de microplacas para agitar suavemente la placa. A continuación, incube los timocitos en un ambiente de 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 17 a 20 horas o durante la noche.

Prepare una lavadora automática de placas de flujo laminar, primero, con 150 mililitros de solución de etanol-Tween, luego, con agua desionizada suplementada con 1% de Tween-20 y, finalmente, con tampón de lavado FACS. Al final de la incubación, utilizando el sistema de lavado de placas, lave la placa con tampón de lavado FACS utilizando un ciclo de lavado de nueve veces. Cada lavado agrega y elimina 55 microlitros de tampón de lavado por flujo laminar, lo que resulta en una dilución exponencial de los reactivos en los pocillos.

Para teñir los antígenos de superficie, primero, diluya una unidad de volumen de anticuerpos anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8 y anti-CD69 en volúmenes de 100 unidades del tampón de lavado FACS. Luego, vuelva a suspender las células en 25 microlitros de la mezcla de anticuerpos de tinción. Use un agitador orbital de microplacas para agitar suavemente el plato y luego déjelo en hielo durante 30 minutos.

Para fijar las células, primero, lave la placa con 55 microlitros de tampón de lavado FACS utilizando nueve veces el ciclo de lavado como se describió anteriormente. Luego, agregue 50 microlitros del tampón de fijación y permeabilización a cada pocillo. Mezclar bien e incubar el plato en hielo durante 30 minutos. Después de la incubación, prepare un tampón de permanente/lavado 1x diluyendo 25 mililitros del caldo 10x proporcionado en 225 mililitros de agua ultrapura.

Prepare la lavadora de placas con 1x tampón y lave la placa con 55 microlitros del 1x tampón usando un ciclo de lavado nueve veces como se describió anteriormente. Mezcle 1 mililitro del anticuerpo anti-caspasa-3 con 2 mililitros del tampón 1x permanente y lavado. Agregue 25 microlitros por pocillo de la mezcla a las celdas fijas.

Use un agitador orbital de microplacas para agitar suavemente la placa. Deje el plato en hielo durante una hora. Al final de la incubación, repita el paso de lavado, nueve veces con la permanente 1x y el tampón de lavado. A continuación, añada 25 microlitros del tampón de lavado FACS a todos los pocillos de la placa, pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces para mezclar la solución.

Finalmente, transfiera las muestras mezcladas a tubos de microtitulación. Rellene los tubos con el tampón de lavado FACS hasta un volumen total de 200 microlitros y proceda al análisis de citometría de flujo.