Identificación de inhibidores de la quinasa que modulan la respuesta de los timocitos a señales fuertes de TCR

Comience con células de timocitos de ratones en una placa de pocillos múltiples. Agregue perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28. A un subconjunto de pocillos, agregue una concentración adecuada del inhibidor de la quinasa de prueba. Incubar.

Los anticuerpos se unen a los receptores CD3 y CD28 de la superficie celular en los timocitos doble positivos y los activan, lo que provoca una regulación a la baja de los receptores de células T, TCR y la activación de la proteína quinasa citosólica.

Estas proteínas quinasas activan las vías de señalización aguas abajo, lo que lleva a una mayor expresión de CD69 en la superficie celular y a la activación citosólica de la caspasa-3. La caspasa-3 activada escinde las proteínas celulares esenciales, iniciando la apoptosis de los timocitos.

En las células tratadas con el inhibidor de la quinasa, los inhibidores bloquean las quinasas citosólicas, modulando la expresión de CD69 y la activación de la caspasa-3.

Pipeta en un cóctel de anticuerpos marcado con fluoróforo que se une a los correceptores TCR, CD4 y CD8 de los timocitos y a los receptores CD69. Tratar los timocitos con un tampón para fijarlos y permeabilizarlos.