Activación de macrófagos derivados de la médula ósea de ratón en respuesta a anticuerpos

Después de la exposición a patógenos, los macrófagos se activan y liberan citoquinas proinflamatorias y antiinflamatorias, coordinando la respuesta del sistema inmunológico.

Para estudiar la activación de macrófagos derivados de la médula ósea in vitro, transfiera una suspensión aislada de células de médula ósea de ratón a un matraz de cultivo. Incubar brevemente.

Las células mesenquimales, los monocitos y los macrófagos maduros se adhieren a la superficie del matraz mientras que los progenitores hematopoyéticos permanecen en suspensión.

Recoger los medios que contienen progenitores hematopoyéticos y centrifugar. Transfiera las células resuspendidas en el medio del factor estimulante de colonias de macrófagos, M-CSF, a un matraz de cultivo.

M-CSF hace que la subpoblación de progenitores mieloides se diferencie en macrófagos, que aparecen ramificados y se adhieren al matraz.

Deseche los medios que contienen células no adherentes. Agregue medios M-CSF e incube. Una vez que los macrófagos alcancen su estado completamente funcional, coseche estomacarlos. Centrífuga.

Macrófagos en placa resuspendidos en medios M-CSF en pocillos de placa de pocillos múltiples. Después de la adherencia de los macrófagos a los pocillos, agregue inmunoglobulinas policlonales humanas y lipopolisacárido bacteriano, LPS, una toxina.

Las inmunoglobulinas se unen a receptores FCγ específicos, mientras que LPS se une a receptores tipo Toll en macrófagos. Esta coestimulación impulsa la activación de macrófagos antiinflamatorios a través de cascadas de señalización posteriores, lo que provoca la liberación de altos niveles de citoquinas antiinflamatorias y bajos niveles de citoquinas proinflamatorias.

Recoja los medios que contienen citocinas para su posterior análisis y confirmar la activación de los macrófagos.

Asegure un ratón sacrificado en decúbito supino en una tabla de espuma con las extremidades extendidas, luego limpie las patas con etanol al 70%. A continuación, haga un corte poco profundo de aproximadamente 2 milímetros de profundidad para eliminar la piel y el pelaje de la superficie de cada pata trasera. Luego, diseccione los tejidos para acceder a las tibias y fémures.

Para extirpar las tibias y los fémures, corte el hueso y los músculos justo debajo de la articulación de la cadera y por encima de los tobillos. Luego, elimine la mayor cantidad posible de tejido muscular de los huesos. A continuación, limpie los huesos con etanol al 70% y deje que se evapore durante 1 minuto, luego, coloque los huesos en una placa de 6 pocillos llena de medio de lavado de huesos.

En la placa, recorte 1 milímetro de cada extremo de los fémures para que sus cavidades internas queden expuestas. Asegúrese de que una aguja de calibre 26 pueda acceder a las cavidades. A continuación, separe la tibia y el fémur de la articulación de la rodilla. Luego, inserte la aguja conectada a una jeringa de 10 mililitros en una cavidad ósea y recoja la médula ósea.

Reúna la médula ósea de los 4 huesos en un tubo cónico de 50 mililitros con 5 mililitros de medio de lavado óseo. Pipetea el medio y la médula hacia arriba y hacia abajo varias veces, o vórtice a baja velocidad para dispersar suavemente los grumos en la suspensión. Los hilos de médula deben romperse en pequeñas motas de médula de menos de medio milímetro de largo.

A continuación, llene el tubo a 50 mililitros con medio de lavado óseo y transfiéralo a un matraz de cultivo de tejidos de 75 centímetros cuadrados. Incuba la médula ósea durante una hora. Durante la incubación, las células maduras se adherirán al matraz y los progenitores hematopoyéticos deseados permanecerán en suspensión. Transfiera la suspensión a un tubo cónico de 50 mililitros y gire las células en un gránulo.

A continuación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento celular en 5 mililitros de medio de cultivo MCSF. Luego, ajuste la densidad de la celda a 500,000 por mililitro y cargue 30 mililitros en un nuevo matraz de 75 centímetros cuadrados. Continúe cultivando las células y en los días 4, 7 y 10, verifique que las células estén adheridas y ligeramente ramificadas con un microscopio de campo claro de contraste de fase invertida.

Al revisar las celdas, deseche el medio que contiene las células no adherentes. Luego, lave las células adherentes con IMDM una vez y agregue 30 mililitros de medio de cultivo MSCF fresco nuevamente en el matraz. El día 10, reemplace el medio con 8 mililitros de tampón de disociación celular basado en EDTA sin enzimas para recolectar las células. Incube las células brevemente, luego, raspe las células suavemente y verifique que se hayan liberado con un microscopio.

Una vez que se liberan las células, transfiera el tampón con las células a un tubo cónico de 50 mililitros, luego enjuague el matraz tres veces con 5 mililitros de IMDM para recolectar más células. Reúna todas las colecciones, centríllelas y vuelva a suspender el gránulo en 3 mililitros de MCSF. Ahora, cuente las células y ajuste su concentración a 1 millón por mililitro.

Luego, coloque 100 microlitros de suspensión celular por pocillo en una placa de fondo plano de 96 pocillos. Todo el plato debe poder llenarse. Cultive las células durante aproximadamente una hora hasta que estén adheridas. Luego, estimule con diferentes concentraciones de LPS o inmunoglobulina intravenosa o ambas, preparadas en IMDM. Realice todas las manipulaciones por duplicado o triplicado y asegúrese de mantener los controles sin tratar, luego, incube las células durante 24 horas y analice los sobrenadantes.