Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 8:18 min. • July 8th, 2025
Para estudiar la inmunidad inducida por la vacuna, tome una inyección llena de una vacuna acelular contra la tos ferina. La vacuna contiene proteínas antigénicas de una bacteria que causa enfermedades respiratorias, Bordetella pertussis, y adyuvantes que extienden la exposición al antígeno para una respuesta inmune sostenida.
Inyecte la vacuna por vía intramuscular en un ratón anestesiado.
Después de la inyección, las células presentadoras de antígenos residentes, APC, capturan y procesan las proteínas antigénicas en péptidos, presentándolas en su superficie. Estas APC luego migran a los ganglios linfáticos cercanos e interactúan con las células T, iniciando su activación y diferenciación en células T efectoras.
Estas células T efectoras circulan y migran a varios órganos, incluidos los pulmones, donde residen como células T de memoria residentes o células TRM, lo que lleva a la inmunización.
Después de la inmunización, administre por vía intranasal una cepa resistente a los antibióticos de Bordetella pertussis viva. Estas bacterias ingresan al tejido pulmonar y activan las células TRM. Las células TRM activadas secretan citocinas inflamatorias que reclutan a las células inmunitarias para causar la eliminación bacteriana.
Recolecte el tejido pulmonar del ratón y homogeneícelo para obtener una suspensión unicelular. Extienda la suspensión celular diluida en una placa de agar que contenga antibióticos e incube para permitir la formación de colonias bacterianas.
El extracto de tejido de un ratón inmunizado exhibe menos colonias en comparación con el de un ratón no inmunizado, lo que confirma la inmunidad inducida por la vacuna contra Bordetella pertussis.
Para la inmunización, confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie en un ratón anestesiado de 6 a 12 semanas de edad y cargue una jeringa de insulina de 1 mililitro equipada con una aguja de calibre 28.5 con 0.1 mililitros de la vacuna de interés. Sosteniendo la jeringa en un ángulo de 45 grados con el bisel hacia arriba, inserte la aguja aproximadamente 5 milímetros en el deltoides del ratón e inyecte la vacuna.
Mantenga la aguja insertada en el músculo durante 5 a 10 segundos. Luego, gire la jeringa 180 grados para que el bisel quede hacia abajo para crear un sello y evitar fugas de vacunas antes de retraer lentamente la aguja del lugar de la inyección. Luego, regrese al ratón a su jaula con monitoreo hasta que se recupere por completo.
Aproximadamente dos semanas después del refuerzo, infecte a los ratones inmunizados. Agarre un ratón anestesiado por el cogote del tórax dorsal detrás de los omóplatos y el cuello, y coloque el ratón en posición vertical para acceder a la nariz. Con una punta de pipeta de 200 microlitros, aplique lentamente de 20 a 25 microlitros del inóculo bacteriano de interés a cada capa del animal, sosteniendo el ratón hasta que se haya inhalado todo el inóculo. Luego, administre un volumen igual de PBS estéril a un grupo de ratones como control negativo.
En el punto final experimental apropiado, coloque un ratón infectado con el lado ventral hacia arriba en una tabla de disección y asegure las extremidades. Humedezca el cuerpo con etanol al 70% y use fórceps para sujetar la piel debajo del abdomen en el centro de la pelvis. Con unas tijeras afiladas, haga un corte vertical hasta la mandíbula y diseccione la piel de la pared peritoneal. Mueva la piel hacia los lados de la canal para crear un campo sin obstrucciones para la sustracción estéril de órganos y agarre el peritoneo intacto debajo de la caja torácica en o cerca del hígado. Corte el peritoneo hacia la caja torácica para exponer el tracto digestivo inferior y mueva el colon hacia la izquierda para revelar el bazo.
Con unas pinzas curvas, agarre el bazo y diseccione el tejido conectivo con unas tijeras. Luego, coloque el bazo en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga 3 mililitros de RPMI y 5% de suero fetal bovino en hielo. Use fórceps para estabilizar la caja torácica en el proceso xifoides y corte el diafragma. Los pulmones deben desinflarse y caer hacia la columna vertebral.
Abra la caja torácica a los lados para quitar la coraza y corte las arterias y venas pulmonares para aislar y extirpar el lóbulo superior del pulmón derecho. Fije el lóbulo en un tubo cónico de 15 mililitros de formalina tamponada neutra al 10% a temperatura ambiente durante al menos 24 horas, y aísle los lóbulos restantes de los pulmones derecho e izquierdo. Luego, coloque los lóbulos en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga 2 mililitros de caseína al 1% en PBS en hielo.
Use un PIPETMAN de 1 mililitro con punta para recolectar la sangre que llena la cavidad torácica y transfiera la sangre a un tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros preetiquetado en hielo. Extirpe las glándulas parótidas, sublinguales y submaxilares, y los ganglios linfáticos que cubren la tráquea, y abra y retire las membranas protectoras que rodean la tráquea. Con fórceps finos y tijeras, separe con cuidado la tráquea del esófago y cualquier otro tejido conectivo desde la parte superior de las clavículas hasta la parte inferior de la mandíbula.
Use fórceps para sostener la tráquea y corte la tráquea en la parte superior de la clavícula. Tire hacia abajo de la tráquea para maximizar la elasticidad y corte la tráquea en la parte inferior de la mandíbula justo encima de la laringe, aislando aproximadamente 1 centímetro de tejido. Luego, coloque el órgano en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros preetiquetado que contenga 0,3 mililitros de caseína al 1% en PBS en hielo.
Ahora, gire el mouse para acceder claramente a la nariz y rocíe la cabeza con etanol al 70%. Manualmente, agarre al animal directamente detrás del cráneo y use unas tijeras para cortar la carne blanda del hocico, comenzando desde la parte inferior de la nariz y moviéndose hacia arriba. Retire el pelaje, la piel y los bigotes de alrededor de la nariz e inserte las puntas de un par de tijeras curvas en las fosas nasales con las curvas apuntando hacia abajo.
Abre el conducto nasal hacia los ojos, creando una formación en forma de V. Luego, use pinzas finas para recolectar el tabique nasal y el tejido blando dentro de la formación, y coloque el tejido en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros preetiquetado que contiene 0.3 mililitros de caseína al 1% en PBS en hielo.
Para procesar el tejido pulmonar, transfiera todo el contenido del tubo de muestra de pulmón a un homogeneizador estéril de 15 mililitros y use un mortero para homogeneizar el tejido. Disociar la muestra hasta que no queden partículas grandes de tejido y devolver la suspensión homogeneizada al tubo original de 15 mililitros. Retire una alícuota de 0,3 mililitros para enchapar unidades formadoras de colonias y recoja el resto del homogeneizado por centrifugación.
Alícuota de 0,5 mililitros del sobrenadante en tubos de microcentrífuga premarcados para su almacenamiento a 20 grados Celsius negativos hasta el análisis de expresión de citoquinas por ELISA. Luego, diluya en serie 0,1 mililitros de alícuotas de la suspensión pulmonar homogeneizada reservada en 0,9 mililitros de PBS estéril por dilución, y use un esparcidor triangular estéril para colocar 0,1 mililitros de cada dilución elegida empíricamente en placas de Bordet-Gengou al 10% más estreptomicina premarcadas.