Dinámica de orgánulos en linfocitos B después de la activación con perlas recubiertas de antígeno

Los

receptores de células B, BCR, en los linfocitos B, se unen a los antígenos, causando la activación celular. Esto conduce a la internalización del antígeno para su procesamiento en fragmentos de péptidos, que se cargan en moléculas MHC de clase II para su presentación a los linfocitos T auxiliares para generar una respuesta inmune efectiva.

Para estudiar la activación de los linfocitos B in vitro utilizando perlas recubiertas de antígeno, primero, obtenga perlas recubiertas de antígeno. Estas perlas están recubiertas covalentemente con antígenos, ligandos específicos para BCR; una proteína no reactiva bloquea los sitios de las perlas no unidas, evitando la unión inespecífica de linfocitos B.

Agregue las perlas a la suspensión de linfocitos B. Siembre la mezcla en un cubreobjetos recubierto de poli-L-lisina.

Los linfocitos B cargados negativamente se unen al cubreobjetos cargado positivamente, inmovilizando las células. Además, los antígenos de las perlas se unen específicamente a los BCR. La interacción del BCR con el antígeno activa los linfocitos B, formando una unión estrecha: una sinapsis inmune.

La interacción inicia vías de señalización intracelular, lo que resulta en la reorganización del citoesqueleto de actina. Esto provoca la propagación de la membrana celular seguida de una contracción, durante la cual el microgrupo de antígenos BCR se concentra en el centro de la sinapsis inmune.

Con la remodelación de la actina, el centrosoma, un centro organizador de microtúbulos, se reposiciona cerca de la sinapsis. El reposicionamiento recluta orgánulos como los lisosomas y el aparato de Golgi cerca de la sinapsis inmune para extraer y presentar antígenos.

Las perlas recubiertas de antígeno se preparan incubando ligandos específicos con perlas de amino previamente tratadas con glutaraldehído para activar los grupos amino. Resuspender las perlas activadas en 100 microlitros de PBS y vórtice. Mientras tanto, prepare la solución de antígeno agregando 100 microgramos por ml de ligando BCR en 150 microlitros de PBS.

A continuación, agregue 50 microlitros de perlas activadas a la solución de antígeno e incube durante la noche a 4 grados centígrados. Recuerde, también use un ligando no relacionado como control negativo. Después de la incubación, lave la perla con PBS, aspire el sobrenadante y reemplácela con PBS. Repita tres veces. A continuación, bloquee los grupos amino libres resuspendiendo las perlas en 500 microlitros de una solución de BSA. Finalmente, resuspenda las perlas en 70 microlitros de PBS.

Para calcular la concentración final, puede usar un hemocitómetro para contar las perlas. Para la activación de las células B, use un tubo de 50 ml y vuelva a suspender las células a una concentración de 1,5 millones por ml en CLICK suplementado con suero fetal bovino al 5%. A continuación, agregue 150,000 células B correspondientes a 100 microlitros de la mezcla de perlas celulares a un cubreobjetos recubierto de poli-L-lisina e incube a 37 grados para los diferentes puntos de tiempo.