Efecto del anticuerpo anti C-fms sobre la osteoclastogénesis en células de médula ósea de ratón in vitro

La osteoclastogénesis es el proceso por el cual los precursores de osteoclastos se diferencian y fusionan para formar osteoclastos multinucleados.

Para estudiar el efecto del anticuerpo anti-c-fms sobre la osteoclastogénesis in vitro, tome una placa de cultivo que contenga una suspensión de células de médula ósea de ratón. Agregue el factor estimulante de colonias de macrófagos, M-CSF.

En cultivo, M-CSF se une a su receptor específico, c-fms, en células precursoras mieloides, activando vías de señalización y causando diferenciación en macrófagos de médula ósea, BMM, que representan precursores de osteoclastos y se adhieren a la placa.

Retire las células no adherentes. Coseche los BMM y siembre en pozos de placas de pocillos múltiples. Suplemento con M-CSF y activador del receptor del ligando del factor nuclear kappa-Β, RANKL.

Agregue concentraciones crecientes de anticuerpos anti-c-fms a los pocillos.

En el pocillo de control, M-CSF se une a los receptores c-fms y activa las vías de señalización, estimulando la expresión del receptor RANK y promoviendo la supervivencia y proliferación de BMM. RANKL se une a los receptores RANK, desencadenando una cascada de señalización y provocando la diferenciación y fusión de BMM en osteoclastos.

En pocillos con concentraciones de anticuerpos más altas, los anticuerpos se unen y bloquean eficazmente los receptores c-fms e interrumpen la señalización requerida para la diferenciación de osteoclastos, inhibiendo así la formación de osteoclastos.

Realice tinciones para identificar y cuantificar las poblaciones de osteoclastos y determinar la concentración efectiva de anticuerpos para inhibir la osteoclastogénesis en la formación de osteoclastos inducida por RANKL.

Siembre 10 millones de células por 10 mililitros en una placa de cultivo de 10 centímetros y agregue M-CSF a las células. Incubar el cultivo a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono durante 3 días. Retire el medio después de tres días y lave las células dos veces, vigorosamente, con 10 mililitros de PBS para eliminar las células no adherentes.

Agregue 5 mililitros de tripsina-EDTA al 0,02% a temperatura ambiente en PBS e incube a 37 grados Celsius, dióxido de carbono al 5% durante 5 minutos. Pipetea bien las células para separarlas. Observe el cultivo bajo un microscopio para asegurarse de que las células se hayan desprendido y parezcan redondeadas y flotando en el medio.

Cuando las células se hayan desprendido, inactive la reacción agregando 5 mililitros de alfa-MEM. Recoja las células en un tubo cónico de 50 mililitros y centrifugue a 300 x g durante 5 minutos. Después de desechar el sobrenadante, lavar con 5 mililitros de alfa-MEM y centrifugar nuevamente a 300 x g durante 5 minutos. Vuelva a suspender el gránulo en 10 mililitros de alfa-MEM.

Siembre 1 millón de células por 10 mililitros en una placa de cultivo de 10 centímetros y agregue M-CSF. Incubar el cultivo a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono durante 3 días. Recolecte las células adheridas, que representan los BMM como precursores de osteoclastos después de 3 días. Siembre BMM a 50,000 células por 200 microlitros de alfa-MEM en una placa de 96 pocillos, por pocillo.

A cada pocillo, agregue los estímulos deseados y luego agregue M-CSF para obtener una concentración final de 100 nanogramos por mililitro. Agregue el anticuerpo anti-c-fms a cada pocillo. Incube la placa a 37 grados Celsius, 5% de dióxido de carbono durante 4 días, mientras cambia el medio cada dos días durante 4 días, y luego proceda con la tinción y los ensayos como se describe en el manuscrito.