Tinción de hematoxilina y eosina para evaluar el daño del colon en la colitis inducida por DSS

El sulfato de sodio de dextrano, o DSS, induce la colitis, una enfermedad inflamatoria intestinal, donde la alteración de la barrera epitelial intestinal conduce a la inflamación.

Para evaluar el daño tisular, tome tejido de colon fijo aislado de un modelo murino de colitis inducida por DSS. Sumerja el tejido en un medio de inclusión para facilitar el corte y congele rápidamente.

Con un criomicrótomo, obtenga una sección delgada de tejido y recójala en un portaobjetos de vidrio.

Sumerja el portaobjetos en una solución que contenga un tinte de hematoxilina oxidado unido al mordiente (un catión metálico) que imparte una carga positiva al tinte. El complejo colorante-mordiente se une al ADN cargado negativamente, tiñendo el núcleo de color púrpura rojizo.

Sumerja el tejido en una solución diferenciadora ácido-alcohol, eliminando el colorante unido no específicamente del citoplasma y la matriz extracelular. Enjuague el tejido en un agente azulado, un medio alcalino, que imparte un color azul a los núcleos, mejorando el contraste.

Sumerja el portaobjetos en concentraciones crecientes de alcohol para deshidratar el tejido mejorando la penetración de la contramancha.

Sumerja el tejido en la contratinción, solución de eosina ácida, que imparte color rosa a las proteínas citoplasmáticas básicas y la matriz extracelular. Lave el portaobjetos con alcohol para eliminar el exceso de eosina. Sumerja el tejido en xileno para que sea transparente, para un mejor examen microscópico.

Bajo un microscopio, la sección del colon muestra un daño tisular agravado, lo que indica colitis inducida por DSS.

Para la tinción de hematoxilina y eosina del tejido del colon aislado, a la mañana siguiente, sumerja los trozos de tejido en sacarosa al 30% en PBS durante la noche en tubos individuales de 15 mililitros para la crioprotección de las muestras. Al día siguiente, incruste los tejidos a una temperatura de corte óptima o compuesto OCT y enfríe los tejidos a menos 20 grados centígrados hasta que la OCT se endurezca.

Coloque los bloques OCT en un criostato y ajuste el dial de grosor a 12 micrómetros, luego, corte y recoja secciones congeladas de 12 micrómetros de espesor en portaobjetos de microscopio de vidrio. Cuando se hayan seccionado todos los tejidos, caliente los portaobjetos a 65 grados Celsius en una placa caliente durante 20 minutos y lave las secciones calentadas brevemente en agua destilada antes de teñir con solución de tinción de hematoxilina durante 5 minutos.

Retire el exceso de solución de hematoxilina en agua corriente del grifo durante 5 minutos y diferencie las secciones con ácido clorhídrico al 0,5% en etanol durante 30 segundos, seguido de un enjuague de 1 minuto con agua corriente del grifo. A continuación, lave las muestras durante 1 minuto en PBS, seguido de otro lavado de 5 minutos con agua corriente del grifo.

Al final del lavado, sumerja los tejidos en una serie ascendente de etanol durante 10 segundos por inmersión, seguido de una contratinción con eosina durante 2 minutos. Para la deshidratación de las muestras, sumerja los portaobjetos en etanol al 95% y 2 cambios de etanol al 100% durante 5 minutos por inmersión, seguido de limpieza con dos cambios de 5 minutos en xileno. Luego, califique el daño tisular en los colones proximal, medio y distal de cada grupo experimental.