Síntesis in vitro de biofilm por Staphylococcus aureus

Las biopelículas bacterianas son estructuras tridimensionales que consisten en comunidades bacterianas incrustadas en una matriz extracelular autogenerada, que evaden la respuesta inmune del huésped.

Para la preparación in vitro de biopelícula de Staphylococcus aureus, transfiera una suspensión de Staphylococcus aureus en crecimiento activo de la densidad celular deseada a los pocillos recubiertos de poli-L-lisina de una placa de pocillos múltiples.

Durante la incubación en condiciones estáticas, el recubrimiento de poli-L-lisina cargado positivamente facilita las interacciones electrostáticas con los glicopolímeros cargados negativamente, como los ácidos teicoicos, en la superficie bacteriana, promoviendo la unión bacteriana.

Con las fuentes de nutrientes disponibles, Staphylococcus aureus se divide y acumula, formando microcolonias. Además, las bacterias secretan una matriz extracelular que comprende polisacáridos, proteínas y ADN extracelular, que encierra células y promueve la cohesión bacteriana y la adhesión a la superficie.

Con la división celular continua y la secreción de la matriz, la biopelícula madura en una estructura tridimensional con una distribución eficiente de moléculas de señalización para la comunicación de célula a célula.

Al alcanzar un umbral de densidad bacteriana, Staphylococcus aureus secreta proteasas y nucleasas, degradando la matriz de la biopelícula y liberando algunos Staphylococcus aureus en el medio. Retire los medios que contengan bacterias planctónicas que flotan libremente.

Agregue suavemente un tampón para evitar la interrupción de la biopelícula. Retire el tampón que contiene cualquier bacteria suelta restante.

La biopelícula generada está lista para experimentos posteriores.

Comience obteniendo colonias aisladas de Staphylococcus aureus de un stock criopreservado utilizando una técnica de placa de rayas en una placa de agar rica en nutrientes como el agar de soja tríptico. Cubra los pocillos individuales de una placa de 96 pocillos con 100 microlitros de PLL diluidos en agua estéril e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Aspire la solución de PLL asépticamente, utilizando una trampa de aspiración asistida por vacío. Deje que los pozos se sequen durante la noche a temperatura ambiente.

Prepare un cultivo durante la noche inoculando una colonia de S. aureus en MEM-alfa suplementada con glucosa al 2% e incube a 37 grados Celsius durante 16 a 18 horas a 200 rotaciones por minuto. Diluya el cultivo durante la noche transfiriendo de 50 microlitros a 5 mililitros de MEM-alfa fresco suplementado con glucosa al 2%. Luego, incubarlo a 37 grados centígrados a 200 rotaciones por minuto hasta lograr la fase logarítmica media. Utilice MEM-alfa para normalizar el cultivo logarítmico medio a una DO de 0,1.

Transfiera 150 microlitros de cultivo normalizado a cada pocillo de la placa de 96 pocillos tratada con PLL. Incube la placa en una cámara humidificada a 37 grados centígrados durante 18 a 20 horas. Aspirar el sobrenadante para eliminar las células planctónicas. Suavemente, lave la biomasa restante con 150 microlitros de HBSS para eliminar las células sueltas. Repita al menos dos veces para eliminar todas las células planctónicas.