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Inmunología
0 vistas • 3:23 min • July 8th, 2025
Para estimular los linfocitos a través de Haemophilus influenzae, una bacteria patógena, tome una suspensión de células mononucleares aisladas de sangre periférica, o PBMC, incluidos linfocitos y células presentadoras de antígenos o APC.
Agregue una suspensión bacteriana e incube a temperatura fisiológica.
Los receptores de reconocimiento de patrones en las APC se unen a componentes específicos de las células bacterianas, desencadenando la fagocitosis. El fagosoma, que contiene bacterias internalizadas, se fusiona con el lisosoma, causando la degradación bacteriana y el procesamiento en fragmentos de péptidos.
Las moléculas principales del complejo de histocompatibilidad o MHC se unen a los fragmentos peptídicos y los presentan en la superficie celular como antígenos. Los linfocitos T se unen al antígeno presentado a través del receptor de células T.
Agregue anticuerpos coestimuladores que se unan a receptores de superficie específicos en los linfocitos T. La unión sinérgica induce la señalización aguas abajo, activando la producción de citocinas de linfocitos T.
Agregue un compuesto bloqueador de Golgi, que bloquea el transporte de proteínas vesiculares desde el retículo endoplásmico hasta el Golgi, para inhibir la secreción de citoquinas de los linfocitos T, lo que facilita la acumulación de citocinas intracelulares.
Agregue un fijador para preservar la morfología celular y un detergente para permeabilizar la membrana celular. Agregue un cóctel de anticuerpos marcados con fluorescencia, incluidos anticuerpos que se unen a los marcadores de superficie específicos de linfocitos T, que etiquetan la superficie celular, y anticuerpos específicos de citocinas que penetran dentro de la célula para unirse a citocinas intracelulares.
Realice citometría de flujo para detectar células con fluorescencia dual, lo que indica la producción de citocinas por parte de los linfocitos T estimulados.
Divida la muestra de sangre periférica en alícuotas para el control y la estimulación del antígeno. Agregue anticuerpos coestimuladores a ambas muestras, luego agregue el H. influenzae no tipificable a la muestra de antígeno e incube a 37 grados Celsius y dióxido de carbono al 5% durante 1 hora.
A continuación, agregue el agente bloqueador de Golgi Brefeldina A a las muestras e incube durante otras cinco horas. Después de lisar los eritrocitos como se demostró anteriormente, fije los leucocitos con 500 microlitros de paraformaldehído al 1% al 2% durante 1 hora. Cuente las células con un hemocitómetro, luego permeabilice 1 millón de células con 100 microlitros de saponina al 0,1% durante 15 minutos.
A continuación, incube las células con anticuerpos apropiados marcados con fluorescencia. Lave las células y luego analícelas con un citómetro de flujo. Determinar la proporción de células que responden a antígenos mediante la activación de las poblaciones de linfocitos relevantes. Realice tinción de fondo en células no estimuladas para todas las citocinas que se analizarán.