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Durante una infección, los linfocitos activados liberan mediadores inflamatorios (citocinas) para provocar una respuesta inmune.
Para cuantificar los mediadores inflamatorios en un tejido infectado, comience con una suspensión celular que contenga células inmunitarias derivadas del tejido pulmonar humano.
Incubar las células con Haemophilus influenzae, una bacteria patógena respiratoria. Los antígenos de superficie de las bacterias interactúan con los receptores de reconocimiento de patrones en las células inmunitarias fagocíticas. Esto inicia la internalización de la bacteria, el procesamiento en péptidos más pequeños y la presentación del péptido por la molécula principal del complejo de histocompatibilidad.
La molécula de antígeno-MHC-II en las células fagocíticas se une a los linfocitos T a través de los receptores de células T, junto con interacciones de receptores coestimuladores, lo que resulta en la activación de linfocitos T y la producción de citoquinas proinflamatorias.
Trate las células con bloqueadores de Golgi, lo que afecta la liberación de citoquinas, lo que provoca su acumulación dentro de las células. Lave las células con un tampón de bloqueo para bloquear los sitios de unión no específicos.
Tiña la suspensión celular con una mezcla de anticuerpos marcados con fluoróforo que se unen específicamente a los marcadores de la superficie de los linfocitos T humanos, lo que permite el etiquetado de los linfocitos.
Fije las células y permeabilícelas con un tensioactivo formador de poros. Incubar las células permeabilizadas con anticuerpos anticitoquinas marcados con fluoróforo, que ingresan a las células e interactúan con citocinas específicas.
Mediante citometría de flujo, mida la señal de fluorescencia de citocinas dentro de los linfocitos marcados, correlacionándose con la producción de mediadores inflamatorios debido a una infección bacteriana.
Corte alrededor de 20 a 40 gramos de la muestra de lobectomía en secciones de 3 a 5 milímetros cúbicos. Colóquelos dentro de una cámara estéril de 50 microlitros y fragmente mecánicamente el tejido con un desagregador adecuado. Después de la desagregación tisular, lisar los glóbulos rojos como se demuestra y volver a suspender las células en RPMI estériles. Luego, filtre las células a través de una malla de nailon estéril de 100 micrómetros y cuente la cantidad de células viables utilizando el método de exclusión de azul de tripano.
Para el ensayo de infección, vuelva a suspender las células pulmonares en RPMI a una concentración final de 4 millones de células por mililitro por tubo. Luego, infecte las células a un MOI de 100 bacterias por célula. Afloje la tapa media rotación para permitir la transferencia de gas en los tubos. Coloque las células en el rotador del tubo e incube a 37 grados centígrados, mientras gira a 12 RPM. Una hora después de la estimulación, agregue Brefeldina A para evitar la exportación extracelular de citoquinas e incube las suspensiones celulares durante otras 16 a 22 horas con rotación.
Al día siguiente, lavar la suspensión celular con 500 microlitros de PBS que contengan albúmina sérica bovina al 1% y azida sódica al 0,01%. A continuación, permanezca en la suspensión celular para marcadores específicos de la superficie de las células de linfocitos humanos durante una hora. Luego, lave las células con PBS y fíjelas y permeabilices, como se demostró anteriormente. A continuación, incube las células con anticuerpos intracelulares que tiñen citoquinas durante una hora. Luego, lave las células y vuelva a suspenderlas en 100 microlitros de PBS, antes de la adquisición de datos en un citómetro de flujo.