Determinación de la producción de ROS por neutrófilos tras la interacción con biofilm opsonizado

Las bacterias marcadas con opsoninas son reconocidas por receptores de neutrófilos específicos, lo que desencadena la fagocitosis con la liberación de especies reactivas de oxígeno, o ROS, y la degradación bacteriana.

Para cuantificar la producción de ROS por neutrófilos in vitro, tome una placa de pocillos múltiples. El pocillo de prueba contiene una biopelícula de Staphylococcus aureus que comprende bacterias incrustadas en la película de matriz extracelular. El pozo de control no tiene la biopelícula.

Incubar la biopelícula con suero humano, permitiendo que las opsoninas séricas opsonicen la biopelícula.

Aspira el suero. Lavar con tampón, eliminando las opsoninas no unidas. Agregue neutrófilos y luminol, un compuesto quimioluminiscente a los pocillos. Centrifugar, acercando los neutrófilos a la biopelícula.

Con un lector de placas, mida la luminiscencia a lo largo del tiempo.

En el pocillo que contiene biopelícula, los neutrófilos se unen a las opsoninas de la biopelícula, provocando la activación de neutrófilos y la internalización bacteriana en fagosomas. Se activan vías de señalización específicas, lo que provoca el ensamblaje de la NADPH oxidasa en los fagosomas.

La NADPH oxidasa cataliza la transferencia de electrones de NADPH al oxígeno molecular, generando ROS que degradan las bacterias. Además, la NADPH oxidasa en la membrana celular libera ROS extracelularmente.

En respuesta, las bacterias de biopelícula producen enzimas que neutralizan las ROS y liberan leucocidinas que forman poros en las membranas de los neutrófilos y causan lisis, interrumpiendo la producción de ROS. El luminol reacciona con las ROS, provocando su excitación, y emite luminiscencia al relajarse.

El pozo de prueba exhibe niveles elevados de ROS en comparación con el control, lo que indica interacciones de biopelícula opsonizada por neutrófilos.

Agregue 100 microlitros de suero humano normal al 20% diluido en HBSS, gota a gota, al biofilm lavado e incube a 37 grados Celsius durante 30 minutos para opsonizar el biofilm. Aspire la solución de suero y lave las biopelículas, gota a gota, con 150 microlitros de HBSS. Aspirar el HBSS, dejando atrás pozos con biopelículas opsonizadas.

Agregue luminol a los neutrófilos resuspendidos en HBSS para formar una concentración final de 5 luminol micromolares. Esta solución está lista para usar para los grupos A y C. Agregue neutrófilos mezclados con luminol a los pocillos con biopelículas opsonizadas.

Para el grupo D, prepare una solución de luminol de 50 micromolares en HBSS en un tubo separado sin neutrófilos y agréguela al pocillo que contiene la biopelícula. Alícuota 350 microlitros de neutrófilos mezclados con luminol, y añadir PMA a una concentración final de 500 nanogramos por mililitro a la mezcla.

Para el grupo B, agregue los neutrófilos de esta mezcla en pocillos sin biopelícula. Esto sirve como un control positivo. Centrifugar la placa a 270 RCF durante 30 segundos a 4 grados centígrados. Asegúrese de que el lector de placas esté configurado a 37 grados Celsius, la luminiscencia y la lectura cinética durante 60 minutos con intervalos de 3 minutos.

Coloque la placa en el lector de placas para medir la producción de ROS por parte de los neutrófilos durante 60 minutos.