Destrucción de células K562 por células mononucleares de sangre periférica expuestas a preparaciones de productos de tabaco

Las células tumorales activan las células inmunitarias efectoras para liberar citocinas y gránulos citolíticos que contienen perforina y granzimas. La perforina forma poros en la membrana celular tumoral, lo que facilita la entrada de la granzima en la célula e inicia la apoptosis, causando la muerte celular.

Para analizar la función citolítica de las células mononucleares de sangre periférica humana, PBMC, después de la preparación de productos de tabaco, TPP, exposición, tome una placa de pocillos múltiples con concentraciones crecientes de TPP. Un pozo que contiene medio actúa como control.

Agregue suspensión PBMC. El principal agente inmunosupresor de los TPP, la nicotina, se une a los receptores nicotínicos de acetilcolina de los PBMC efectores, regulando a la baja la producción de citoquinas proinflamatorias.

centrífuga. Retire el sobrenadante que contiene TPP. Volver a suspender los PBMC en los medios. Agregue células K562 marcadas con fluorescencia, células leucémicas humanas que tienen una mayor susceptibilidad a la citotoxicidad de las células efectoras de PBMC, a los pocillos.

Las células efectoras tratadas con TPP con respuestas inmunitarias suprimidas exhiben una expresión reducida de perforina y liberación de citoquinas, lo que disminuye la capacidad citolítica de la PBMC.

centrífuga. Vuelva a suspender las células en un tampón seguido de un tinte fluorescente impermeable a las células. El tinte ingresa a las células con membranas comprometidas y tiñe el ADN.

Usando un citómetro de flujo, determine la proporción de células K562 muertas y vivas en los pocillos. Un porcentaje más bajo de células K562 muertas en pocillos con concentraciones de TPP más altas que el control indica la supresión de la muerte de células K562 por PBMC tratadas con TPP.

Después de preparar una placa de PBMC tratados con productos de tabaco, como se acaba de demostrar, lave un cultivo de células K562 recolectadas a una confluencia del 80% en 10 mililitros de DPBS. Vuelva a suspender el gránulo en 5 mililitros de DPBS y cuente las células. Luego, agregue 1 mililitro de solución de trabajo CFSE recién preparada a 1 a 2 veces 10 a las séptimas células K562 en 1 mililitro de medio completo y disperse la tinción celular por vórtice.

Incube las células a temperatura ambiente. Después de exactamente 2 minutos, agregue 200 microlitros de FBS y vuelva a agitar las células, incubándolas durante otros dos minutos.

Después de la segunda incubación, lave las células en 10 mililitros de medio completo. Luego, vuelva a suspender el gránulo en otros 10 mililitros de medio completo y cuente las células. Ahora, centrifuga los PBMC tratados con tabaco y decanta el sobrenadante. Luego, vuelva a colocar la tapa, vuelva a suspender las celdas por vórtice y lávelas en 200 microlitros de medio completo por pocillo.

Para iniciar el ensayo de muerte, agregue las células K562 marcadas con CFSE a las PBMC en una proporción de 1 a 15 e incube el cocultivo a 37 grados Celsius y 5% de CO2.

Después de cinco horas, gire las células hacia abajo y deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender los gránulos mediante vórtices y luego lave las células con 200 microlitros de tampón de funcionamiento por pocillo. Luego, agregue 95 microlitros de tampón de funcionamiento seguido de 5 microlitros de 7-AAD, para un volumen total de 100 microlitros por pocillo.

Finalmente, incube las células en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos, luego, agregue 100 microlitros de tampón de funcionamiento a cada pocillo y transfiera todo el volumen a los tubos FACS correspondientes apropiados para determinar el porcentaje de células positivas para 7-AAD y CFSE mediante análisis de citometría de flujo.