JoVE Encyclopedia of Experiments
Inmunología
0 vistas • 4:21 min • July 8th, 2025
Tome una placa de varios pocillos que contenga un cultivo de macrófagos. Infectar con Listeria monocytogenes que expresa proteínas fluorescentes, Lm.
Las proteínas en Lm se unen a receptores de macrófagos específicos, internalizando las bacterias dentro de un fagosoma. Además, Lm secreta toxinas formadoras de poros que alteran la membrana del fagosoma, liberando bacterias en el citosol, donde se replican y quedan rodeadas por filamentos de actina del huésped.
Las proteínas ActA inductoras de ensamblaje de actina en Lm inducen una polimerización continua de actina en el extremo posterior de la bacteria. La cola de cometa de actina generada impulsa a Lm a través del citosol y penetra en la membrana celular de los macrófagos, liberando Lm polimerizada envuelta en actina en el medio.
Después de la incubación, recolecte y fije los medios extracelulares, unidos a actina y que contienen Lm de un conjunto de pocillos. Arregle el Lm usando paraformaldehído. Agregue agua destilada, rompiendo los macrófagos y liberando el Lm intracelular. Recoger el Lm intracelular y fijar la muestra con paraformaldehído.
En otros pocillos, reemplace los medios con medios que contengan gentamicina impermeables a las células para eliminar la Lm extracelular. Reemplace con medios nuevos e incube durante el período deseado.
Después de la incubación, recolecte los medios extracelulares que contienen Lm y fije la muestra con paraformaldehído. Utilice agua destilada para obtener lisado que contenga Lm intracelular y fije la muestra con paraformaldehído. Agregue faloidina marcada con fluorescencia a las muestras, que se une selectivamente a la actina polimerizada.
Usando un citómetro de flujo, visualice las señales fluorescentes de Lm y faloidina de unión a actina en las muestras. Cuantificar la Lm unida a actina extracelular e intracelular derivada de los macrófagos infectados.
Usando un contador de celdas automatizado, ajuste las celdas RAW 264.7 preparadas a la concentración de 1 x 106 celdas por mililitro. Agregue 1 mililitro de la muestra a los pocillos de una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos. Infectar las células con inóculo de Lm preparado correspondiente a una multiplicidad de infección de 50.
A las 1,5 horas después de la infección, en un tubo de microcentrífuga de 1,5 milímetros lleno de 500 microlitros de PFA al 4%, recoja los medios del primer conjunto de pocillos y coloque el tubo en hielo. Para recolectar Lm intracelular, agregue 1 mililitro de agua estéril destilada a cada pocillo. Después de 60 segundos, transfiera el lisado de agua resultante a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros con 500 microlitros de PFA al 4%. Agite el tubo vigorosamente durante 10 segundos y colóquelo sobre hielo.
Para los pocillos restantes, retire el medio y reemplácelo con 1 mililitro de DMEM / FCS con 5 microgramos por mililitro de gentamicina para matar el Lm extracelular. Regrese rápidamente el plato a la incubadora.
Después de 30 minutos, retire el medio y reemplácelo con DMEM / FCS sin gentamicina. Después de otras dos y cuatro horas, recoja los medios en lisados para el segundo y tercer punto de tiempo en los tubos y colóquelos sobre el hielo para que se enfríen. Centrifugar tubos a 10.000 veces g durante 7 minutos.
Con una pipeta, elimine el sobrenadante sin alterar el gránulo. Agregue el cóctel de tinción que contiene 50 microlitros de PFA al 4% y 15 microlitros de faloidina en el tubo y mezcle para resuspender cada gránulo. Incube los tubos en la oscuridad a 4 grados centígrados durante 20 minutos.
Después de la incubación, agregue 1 mililitro de tampón FACS a cada tubo y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Centrifugar los tubos en la centrífuga a 10.000 veces g durante 7 minutos. Retire el sobrenadante sin alterar el sedimento.
Para su uso inmediato, suspenda cada pellet en 400 microlitros de tampón FACS. Si se almacena para un análisis posterior, agregue 200 microlitros de tampón FACS y 200 microlitros de PFA al 4% en el tubo y mezcle para suspender.