Detección de la activación del inflamasoma mediante microscopía de fluorescencia

Para detectar la activación del inflamasoma del receptor P3 similar a NOD, o NLRP3, tome una placa de pocillos múltiples que contenga macrófagos activados que expresan proteínas NLRP3.

Tratar las células con medios que contengan ionóforos y glicina. Los ionóforos inducen la salida de iones de potasio, activando y oligomerizando las proteínas NLRP3. El NLRP3 oligomerizado recluta proteínas adaptadoras, lo que facilita la unión de la pro-caspasa-1, formando el complejo inflamatorio NLRP3.

En el inflamasoma, la proximidad desencadena la autoescisión de pro-caspasa-1, liberando caspasas activas, iniciando piroptosis y condensación nuclear. Además, la glicina estabiliza la estructura celular, evitando la lisis celular.

Trate los macrófagos con sondas reporteras fluorescentes que contengan un grupo de unión de caspasa-1 y un fluoróforo unido a través de una secuencia de aminoácidos. La caspasa-1 activada reconoce la secuencia de aminoácidos de la sonda y se une a su grupo de unión a caspasa, lo que permite su visualización.

Fije las células y cúbralas con tinte fluorescente para teñir los núcleos. Imagen bajo un microscopio de fluorescencia.

Cuente macrófagos con núcleos condensados azules y focos fluorescentes verdes de caspasa-1 activada, lo que sugiere la activación del inflamasoma NLRP3.

Comience reemplazando el medio de macrófagos derivados de la médula ósea preparados con LPS sembrados en cubreobjetos de vidrio con 290 microlitros de medio DMEM-5 suplementado con nigericina 5-micromolar y glicina 5-milimolar por pocillo. Regrese la placa de 24 pocillos a la incubadora de cultivo celular durante 60 minutos a 37 grados centígrados y dióxido de carbono al 5%, agregando 10 microlitros de 30X FAM-YVAD-FMK después de los primeros 15 minutos.

Al final de la incubación, lavar las células con 1 mililitro de PBS frío por pocillo tres veces durante 5 minutos por lavado, y fijar las células con 250 microlitros de paraformaldehído al 2% por pocillo durante 30 minutos en hielo, protegidas de la luz, marcando las células con un tinte nuclear fluorescente apropiado durante los últimos cinco minutos.

Al final de la incubación, lave las celdas tres veces con PBS frío como se acaba de demostrar, y cargue cada portaobjetos con 7 microlitros de medio de montaje antidecoloración. Coloque un cubreobjetos en cada portaobjetos y deje que el medio de montaje se endurezca durante la noche antes de sellar los cubreobjetos con esmalte de uñas.

Para obtener imágenes de las células mediante microscopía confocal de fluorescencia, coloque el portaobjetos de control no tratado en la platina del microscopio y enfoque manualmente las células. Usando la configuración de la tabla de búsqueda del microscopio, ajuste el desplazamiento hasta que no se observe ninguna sonda positiva en las células no tratadas.

A continuación, utilizando una muestra tratada con nigericina, localice un campo que contenga células que sean tanto positivas como negativas para la tinción de la sonda, y ajuste el plano de imagen del canal de la sonda al plano que tiene la mayor intensidad de tinción positiva. Luego, ajuste la ganancia hasta que los focos sean visibles en las células con núcleos condensados y obtenga imágenes de cinco campos seleccionados al azar por portaobjetos con un aumento total de 100X.