Una técnica in vitro para estudiar la formación de complejos inflamasomas en macrófagos

0 vistas3:06 min • July 8th, 2025

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Comience con una placa que contenga un cultivo de macrófagos primarios.

Introducir lipopolisacárido bacteriano, LPS, que se une a los receptores tipo toll en los macrófagos, desencadenando la regulación positiva de la familia de proteínas NLR que contiene el dominio de pirina 3 o NLRP3.

Agregue un ionóforo que medie la salida de iones de potasio. La disminución del potasio citosólico activa NLRP3. El NLRP3 activado oligomeriza e induce el reclutamiento de una proteína adaptadora, que a su vez recluta pro-caspasa-1, formando un inflamasoma.

La autoproteólisis convierte la pro-caspasa-1 en caspasa-1 activa, que media la muerte celular inflamatoria o piroptosis. El daño del ADN durante la piroptosis conduce a la condensación nuclear.

Fije las células y trátelas con un detergente para permeabilizarlas.

Agregue un anticuerpo primario que se une a la proteína adaptadora asociada al inflamasoma y un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia que se une al anticuerpo primario, marcando el inflamasoma.

Introduzca una tinción de ácido nucleico fluorescente para etiquetar el núcleo. Bajo un microscopio de fluorescencia, las células muestran núcleos condensados, lo que indica piroptosis, y focos de proteínas adaptadoras, lo que indica la formación de inflamasomas.

Para el análisis inmunofluoroquímico de las células tratadas con nigericina, lave las células marcadas con sonda e incube las células en 250 microlitros de solución de fijación y permeabilización por pocillo durante 30 minutos en hielo, protegidas de la luz.

Lave los macrófagos tres veces más con tampón de lavado fresco y etiquete las células con 250 microlitros de anticuerpo primario contra la proteína similar a una mancha asociada a la apoptosis que contiene un dominio de reclutamiento de caspasa C-terminal, o ASC, por pocillo durante una hora en hielo.

Lave las células al final de la incubación y etiquete las muestras con 250 microlitros del anticuerpo secundario conjugado con colorante fluorescente apropiado durante otra hora en hielo, agregando 4 microlitros de un tinte nuclear fluorescente apropiado durante los últimos 5 minutos.

Después de lavar las células 3 veces en tampón de lavado en frío, monte cubreobjetos en los portaobjetos con 7 microlitros de medio de montaje antidecoloración como se demuestra, y obtenga imágenes de los macrófagos mediante microscopía confocal de fluorescencia.

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Última actualización: 1 agosto 2026