Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 3:02 min. • July 8th, 2025
Tome una placa de ensayo que contenga macrófagos preparados con lipopolisacáridos.
El cebado aumenta la expresión de precursores de citoquinas proinflamatorias inactivas y proteínas NLRP3.
Agregue nigericina, un ionóforo de potasio, que promueve la salida de iones. Esto altera los niveles de potasio intracelular, lo que desencadena las proteínas NLRP3 para formar un gran complejo.
El NLRP3 oligomerizado recluta las proteínas adaptadoras, ASC, provocando su polimerización. Los filamentos de ASC reclutan pro-caspasa-1, formando NLRP3-inflamasoma, un complejo multiproteico.
La pro-caspasa-1 se somete a una autoactivación inducida por proximidad, generando caspasa-1. La caspasa-1 escinde la citocina proinflamatoria y la proteína gasdermina-D, creando un poro de la membrana plasmática.
Esto da como resultado la secreción de citoquinas y la muerte celular programada inflamatoria, piroptosis, liberando contenidos intracelulares, incluida la lactato deshidrogenasa o LDH. Recoge el sobrenadante que contiene LDH.
Agregue la mezcla de sustrato: lactato, violeta de yodonitrotetrazolio o tinte INT, NAD+ y diaforasa. La LDH oxida el lactato a piruvato mientras reduce el NAD+. La diaforasa cataliza la reducción de INT, formando formazán de color rojo.
La intensidad del color corresponde a la liberación de LDH, con niveles elevados que indican un aumento del daño celular asociado a la piroptosis y la muerte.
Para realizar un ensayo de liberación de LDH, agregue 50 microlitros de medio DMEM-5 suplementado con 10 micromolares de nigericina a cada pozo experimental, y 50 microlitros de DMEM-5 a los pocillos de control de lisis espontáneos y 100% durante 60 minutos a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Después de 30 minutos, agregue 10 microlitros de tampón de lisis 10x a los pocillos de control de lisis al 100% y agregue 10 microlitros de medio a los otros pocillos. Al final de la incubación, centrifugar la placa y transferir 50 microlitros de sobrenadante de cada pocillo a una placa transparente de fondo plano.
A continuación, agregue 50 microlitros de sustrato recién descongelado y preparado a cada pocillo para una incubación de 30 minutos en la oscuridad, revisando la placa después de 15 minutos para confirmar que la señal no excederá el límite de detección del lector de placas. Al final de la incubación, agregue 50 microlitros de solución de parada a cada pocillo y mida el OD490 en un lector de placas apropiado para permitir el cálculo del porcentaje de lisis celular por pocillo.