$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Comience con una placa de pocillos múltiples que contenga neutrófilos marcados con fluorescencia y trátelos con suero de paciente que contenga anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos.
Estos anticuerpos interactúan con los receptores Fc de los neutrófilos, activando una vía de señalización, produciendo especies reactivas de oxígeno o ROS y activando la peptidil arginina deiminasa.
Las ROS provocan la desgranulación de los neutrófilos, liberando enzimas: elastasa y mieloperoxidasa en el citoplasma. Estas enzimas y peptidil arginina deiminasas activadas se translocan al núcleo.
La elastasa escinde la histona-H1 y la mieloperoxidasa modifica las histonas, iniciando la descondensación de la cromatina. La peptidil arginina deiminasa activada induce la citrulinación de histonas, convirtiendo los residuos de arginina en citrulina y contribuyendo a una mayor descondensación.
La cromatina descondensada se mezcla con proteínas intracelulares, incluidas proteínas antimicrobianas y citoplasmáticas. Más tarde, la membrana del neutrófilo se desintegra, liberando cromatina descondensada mezclada con proteínas citoplasmáticas en el espacio extracelular, formando una trampa extracelular de neutrófilos, NET.
Agregue un tinte de ADN impermeable a las células, que se une exclusivamente al ADN extracelular en los NET. Bajo un microscopio de fluorescencia, los neutrófilos aparecen rojos con estructuras verdes extracelulares en forma de red, lo que confirma la formación de NET.
Hacer una suspensión celular a una densidad de 420.000 células por mililitro en medio RPMI-1640 sin rojo de fenol que contenga un 2% de FCS. Agregue 37,500 neutrófilos en 90 microlitros a cada pocillo de una placa negra de fondo plano de 96 pocillos.
A continuación, añade 10 microlitros del estímulo elegido, por triplicado, hasta alcanzar una concentración del 10% en cada pocillo. Incluya siempre un control negativo por triplicado. Incube en la oscuridad a 37 grados centígrados durante el tiempo deseado, que oscila entre 30 minutos y 2, 4 o 6 horas. Luego, prepare el volumen de colorante de ADN impermeable necesario para agregar 25 microlitros de colorante de ADN impermeable de 5 micromolares para alcanzar una concentración final de 1 micromolar en cada pocillo.
15 minutos antes del final del tiempo de incubación, agregue 25 microlitros de colorante de ADN impermeable de 5 micromolares a cada pocillo. Continúe la incubación durante los últimos 15 minutos a 37 grados centígrados en la oscuridad. Después de esto, retire el sobrenadante con mucho cuidado y guárdelo si es necesario. Agrega 100 microlitros de paraformaldehído al 4%. Mantenga el plato en la oscuridad e inmediatamente continúe con la siguiente sección.
Después de configurar los ajustes, seleccione Serie Z. Seleccione 10 como número de pasos. Seleccione 3 micrómetros como tamaño de paso. Cargue la placa en el microscopio confocal de inmunofluorescencia.
Haga clic en la pestaña Ejecutar. Complete el nombre y la descripción de la placa y elija la ubicación de almacenamiento. Seleccione los pozos que deben adquirirse. Elija el tiempo de exposición para Texas Red y FitC, luego haga clic en Adquirir placa e inicie la adquisición, que tomará aproximadamente 1 hora por placa.
Después de esto, seleccione Macro de análisis. A continuación, seleccione W1 y elija el valor de umbral. A continuación, seleccione el valor de píxel deseado y, finalmente, en una segunda ventana de ImageJ, seleccione W2 y elija el valor de umbral con el valor de píxel deseado. Seleccione un destino para el archivo de hoja de cálculo. Ejecute el análisis y guarde el archivo de registro después.