Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 2:57 min. • July 8th, 2025
Tome un tubo de vidrio que contenga homogeneizado de neutrófilos con componentes intracelulares liberados.
Agregue metanol, un solvente polar, que interrumpe las interacciones lípido-lípido y lípido-proteína. La polaridad inherente del metanol distribuye uniformemente los lípidos polares, solubilizándolos. A continuación, agregue cloroformo, un solvente orgánico no polar, que interactúa con los lípidos no polares, lo que hace que se dispersen y solubilicen.
Centrífuga para separar el gránulo que contiene proteínas del sobrenadante que contiene lípidos, polisacáridos y restos celulares. Transfiera el sobrenadante a un tubo de vidrio nuevo. Agregue cloroformo y agua destilada. Centrifugar la muestra.
La adición de agua forma espontáneamente un sistema bifásico, dividiendo las biomoléculas dentro de las capas inferiores de cloroformo y las capas superiores de agua-metanol.
La capa de cloroformo comprende lípidos no polares disueltos, mientras que la capa superior contiene contaminantes no lipídicos y más lípidos polares. Retire la capa superior de agua-metanol sin alterar la capa que contiene lípidos.
Use un concentrador de vacío para eliminar el solvente de los lípidos. Almacenar a temperaturas más bajas hasta su uso posterior.
Para aislar los lípidos de los neutrófilos humanos derivados de la sangre periférica, tome los neutrófilos preparados y colóquelos en hielo. Pipetee los neutrófilos a un tubo de vidrio con tapón de rosca de 15 mililitros con sello de PTFE y homogeneícelos agitándolos durante un minuto. Luego, agregue 2 mililitros de metanol, seguido un minuto después por 1 mililitro de cloroformo. Después de agitar durante otro minuto, gire los tubos de vidrio a temperatura ambiente y 50 RPM durante 30 minutos.
A continuación, granular la fracción de proteína centrifugando la solución a 7 grados centígrados y 1952 veces g durante 10 minutos. Decanta cuidadosamente el sobrenadante en un nuevo tubo de vidrio con tapón de rosca de 15 mililitros, dejando atrás el gránulo que contiene proteínas. Almacene el gránulo a menos 20 grados Celsius para una cuantificación futura.
Agrega 1 mililitro de cloroformo y espera un minuto. Luego, agregue 1 mililitro de agua destilada doble e invierta el tubo de tapón de rosca de vidrio con la muestra durante 30 segundos. Después de centrifugar la muestra como antes, retire y deseche la fase superior hasta la capa turbia, pero sin incluirla. Seque las muestras en un concentrador de vacío a 60 grados centígrados y guárdelas a menos 20 grados centígrados hasta que las necesite.