JoVE Encyclopedia of Experiments
Inmunología
0 vistas • 3:25 min • July 8th, 2025
Tome una placa de pocillos múltiples que contenga macrófagos.
Agregue Cryptococcus neoformans a los pocillos de prueba, mientras que los pocillos de control contienen solo macrófagos.
Los macrófagos fagocitan hongos dentro de los fagosomas.
Lavar con tampón para eliminar los hongos no fagocitados. Agregue medios libres de antibióticos. Incubar.
El fagosoma se fusiona con el lisosoma, formando un fagolisosoma. Los hongos modulan el pH de los fagolisosomas y poseen mecanismos intrínsecos para sobrevivir a condiciones fagolisosomales adversas. Los hongos permeabilizan la membrana fagolisosomal y se replican, acompañados de una acumulación citosólica de vesículas llenas de polisacáridos.
La residencia y replicación de hongos intracelulares causan daño celular, desencadenando vías de muerte celular. Esto provoca la lisis de macrófagos y la liberación de contenido intracelular, incluida la lactato deshidrogenasa o LDH, en el medio.
Recopile medios que contengan LDH en diferentes puntos de tiempo. Lisar los macrófagos de control en puntos de tiempo similares para obtener la máxima liberación celular de LDH. Agregue la mezcla de ensayo a los medios recolectados y lisados. La LDH convierte el lactato en piruvato, reduciendo el NAD+. La diaforasa reduce la sal de tetrazolio, formando un producto de formazán rojo.
Con un lector de placas, mida la absorbancia de formazán para cuantificar la lisis de macrófagos después de la infección por Cryptococcus neoformans.
Para preparar células fúngicas para una infección por macrófagos, recolecte y centrifugue células de C. neoformans de un cultivo de fase logarítmica media, seguido de tres lavados suaves con 1 mililitro de PBS a temperatura ambiente en las mismas condiciones de centrífuga.
Después del último lavado, vuelva a suspender las células fúngicas a una concentración de medio de cultivo celular libre de antibióticos de 1,2 veces 10 a ocho células por mililitro, y agregue 1 mililitro de suspensión de células fúngicas a cada uno de los 4 pocillos de una placa de cultivo de macrófagos confluente de 6 pocillos del 70% al 80%. Luego, coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante tres horas. Incline con cuidado la placa para permitir que cada pocillo se lave suavemente tres veces con 1 mililitro de PBS por pocillo por lavado.
Para medir la competencia en infecciones después del último lavado, agregue 1 mililitro de medio libre de antibióticos a cada pocillo de la placa de 6 pocillos y coloque la placa en la incubadora de cultivos celulares. En los puntos de tiempo experimentales apropiados, recolecte el sobrenadante de cada pocillo y mida la cantidad de LDH en cada pocillo de acuerdo con los protocolos estándar. Al mismo tiempo, lisar las células de macrófagos no infectadas para determinar el valor de citotoxicidad máxima.
La citotoxicidad se puede calcular utilizando la fórmula indicada.