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Tome un sistema de infección de dos cámaras separado por un inserto de membrana permeable. El compartimento inferior contiene queratinocitos humanos adherentes o células de la piel.
Agregue patógenos bacterianos en la cámara superior e incube. La membrana evita el contacto directo de los patógenos con los queratinocitos. Los patógenos secretan estreptolisina S o SLS, una pequeña toxina, que atraviesa la membrana para llegar a las células.
El cotransportador de bicarbonato de sodio en los queratinocitos media la afluencia de iones de bicarbonato y sodio, manteniendo el pH intracelular. El SLS se une al cotransportador e interrumpe el transporte de iones, lo que provoca estrés osmótico intracelular.
La señalización aguas abajo inducida por el estrés provoca la degradación del inhibidor unido al factor nuclear Kappa B secuestrado, o NF-κB, lo que lleva a su activación. El NF-κB activado se transloca al núcleo, lo que lleva a la regulación positiva de la producción de citoquinas proinflamatorias.
Tras la secreción extracelular, las citocinas se unen a los receptores de muerte en la célula huésped, iniciando necrosis. Después de la incubación, coseche el sobrenadante de cultivo para evaluar el impacto de la toxina bacteriana.
Inmediatamente antes del tratamiento, use 1X PBS para lavar las células. Luego, aplique 2 mililitros de medio de crecimiento fresco con o sin tratamiento farmacológico a las placas de seis pocillos, o 0,5 mililitros de medio a los pocillos de las placas de 24 pocillos. A continuación, debajo de una campana de flujo laminar, use pinzas estériles para colocar cuidadosamente un inserto de membrana permeable estéril de 0.4 micrones en cada pocillo.
El manejo suave y estéril de los insertos permeables durante la preparación para infecciones es fundamental para evitar que la membrana se vea comprometida o contaminada durante este proceso.
Aplique medio de cultivo celular fresco en la cámara superior de cada pocillo, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego, aplique un volumen apropiado de los cultivos bacterianos normalizados a la cámara superior del sistema de inserción de membrana permeable y aplique medio bacteriano a los pocillos de control.
La adición cuidadosa de las bacterias a la cámara superior, así como el transporte suave de las células infectadas a la incubadora, son fundamentales, porque es esencial que las bacterias no contaminen la cámara inferior durante la configuración experimental.
Para evaluar las proteínas del huésped secretadas, use fórceps estériles para retirar con cuidado el inserto de membrana permeable. Luego, sin alterar la monocapa de células, recoja el medio de la cámara inferior en tubos de 1,5 mililitros.
Centrifugar las muestras a 14.000 RCF y 4 grados Celsius durante 10 minutos para granular los restos celulares. Luego, retire todos menos 50 microlitros del sobrenadante, transfiéralo a un tubo nuevo de 1,5 mililitros y guárdelo a menos 20 grados centígrados, o úselo inmediatamente.