JoVE Encyclopedia of Experiments
Inmunología
0 vistas • 4:15 min • July 8th, 2025
Comience sembrando células huésped de mamíferos en el compartimento inferior de un sistema de membranas permeables.
Agregue Streptococcus, una bacteria patógena conocida por secretar estreptolisina S o toxina SLS, al inserto de membrana. La toxina SLS se difunde a través del poro de la membrana y llega a la célula huésped.
Los cotransportadores de sodio-bicarbonato unidos a la membrana regulan el transporte de iones, manteniendo la homeostasis celular. La toxina se une a estos cotransportadores, interrumpiendo el transporte de iones y causando estrés osmótico en las células huésped.
Esto activa varias cascadas de señalización aguas abajo, incluida p38 MAPK, una vía de proteína quinasa activada por mitógenos. El p38 MAPK activado fosforila sus objetivos aguas abajo, iniciando una respuesta celular contra las bacterias.
A continuación, retire el inserto de membrana permeable. Aspirar el medio por encima de las células huésped. Agregue tampón de lisis para liberar el contenido celular. Centrífuga para granular los restos celulares.
Recoja el sobrenadante que contiene componentes de lisado solubles y el gránulo que contiene componentes de lisado insolubles. Almacene las muestras para su posterior análisis.
Inmediatamente antes del tratamiento, use 1X PBS para lavar las células. Luego, aplique 2 mililitros de medio de crecimiento fresco con o sin tratamiento farmacológico a las placas de seis pocillos, o 0,5 mililitros de medio a los pocillos de las placas de 24 pocillos. A continuación, debajo de una campana de flujo laminar, use pinzas estériles para colocar con cuidado un inserto de membrana permeable estéril de 0.4 micrones en cada pocillo.
El manejo suave y estéril de los insertos permeables durante la preparación para infecciones es fundamental para evitar que la membrana se vea comprometida o contaminada durante este proceso.
Aplique medio de cultivo celular fresco en la cámara superior de cada pocillo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego, aplique un volumen apropiado de los cultivos bacterianos normalizados a la cámara superior del sistema de inserción de membrana permeable y aplique medio bacteriano a los pocillos de control.
La adición cuidadosa de las bacterias a la cámara superior, así como el transporte suave de las células infectadas a la incubadora, son fundamentales, porque es esencial que las bacterias no contaminen la cámara inferior durante la configuración experimental.
Use pinzas estériles para quitar con cuidado el inserto de membrana permeable.
Para la evaluación de los lisados de células huésped, aspire suavemente el medio por encima de la monocapa sin alterar las células huésped. Luego, use PBS para enjuagar las células una vez. Aspire suavemente el PBS e inmediatamente aplique un volumen de tampón de lisis helado para lograr, por ejemplo, una concentración de proteína de 0,5 a 1,5 miligramos por mililitro. Luego, incube las muestras en hielo durante 15 minutos.
A continuación, use un raspador de celdas para separar las celdas de la superficie de la placa de cada pocillo y transfiera todo el contenido de cada pocillo a un tubo de 1,5 mililitros. Luego, centrifuga las muestras a 14,000 RCF y 4 grados Celsius durante 20 minutos.
Para evaluar los componentes solubles del lisado, transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y guárdelo a menos 20 grados centígrados, o utilícelo inmediatamente. Para evaluar los componentes de lisado nucleares u otros componentes insolubles, reserve el gránulo y guárdelo a menos 20 grados centígrados, o utilícelo inmediatamente.