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Tome una cámara de imágenes que contenga un cultivo de células epiteliales humanas cargadas con un indicador fluorescente de calcio intracelular.
Agregue un medio de cultivo que contenga iones de calcio. Introducir Shigella, una bacteria patógena, e incubar.
El sistema de secreción bacteriana penetra en la célula huésped y libera efectores de invasión. La invasión desencadena el reordenamiento de la actina, formando membranas que se agitan alrededor de las bacterias.
En el sitio de invasión, se activa la fosfolipasa C, o PLC, en la membrana plasmática y los receptores de trifosfato de inositol se agrupan en el retículo endoplásmico o RE.
El PLC hidroliza el fosfatidilinositol de membrana 4,5-bisfosfato a trifosfato de inositol, o IP3, que se acumula localmente debido a la densa malla de actina.
IP3 se une a los receptores en el RE, lo que provoca la liberación de calcio. Los indicadores de calcio se unen a los iones liberados y emiten fluorescencia, mostrando una respuesta local de calcio.
IP3 se difunde lentamente a través de la actina, agotando aún más el nivel de calcio del RE y activando un canal de calcio de la membrana plasmática, lo que lleva a la entrada de calcio.
La fluorescencia a través de la célula indica una respuesta global de calcio retardada.
Coloque el cubreobjetos que contiene las células Fluo-4 en una cámara de imágenes o con fondo de vidrio. Utilice el tampón EM para lavar la muestra tres veces para eliminar los compuestos que pueden resultar de la lisis celular. Luego, agregue un mililitro de tampón EM. Coloque la cámara en una platina de microscopio de fluorescencia invertida, calentada a 33 grados centígrados. Seleccione un campo de microscopía y configure los parámetros de adquisición, incluido el tiempo de exposición y el agrupamiento, si es necesario, para optimizar la señal fluorescente Fluo-4.
Para agregar bacterias a la muestra, retire con cuidado 500 microlitros de tampón EM de la cámara y agregue 500 microlitros de la suspensión bacteriana para obtener un OD600 final de 0.05. Realice inmediatamente una adquisición o espere 10 minutos para permitir que las bacterias se sedimenten en las células. Al final de la corriente de adquisición, adquiera una imagen de contraste de fase del campo seleccionado para visualizar las bacterias que entran en contacto con las células y las ondulaciones de la membrana asociadas con los sitios de invasión bacteriana.
Repita el procedimiento de adquisición a intervalos que sean adecuados a la duración de las adquisiciones de imágenes, el ahorro de archivos y la selección de un nuevo campo para cubrir todo el proceso. Al final del procedimiento de adquisición, agregue a la muestra dos micromolares del ionóforo de calcio ionomicina para determinar la amplitud máxima de las señales de calcio. Adquiera imágenes cada 3 a 5 segundos hasta que la señal se estabilice, generalmente durante menos de 10 minutos.
A continuación, agregue el quelante de calcio EGTA a una concentración final de 10 milimolares para determinar la señal fluorescente en ausencia de calcio. Adquiera imágenes cada 3 a 5 segundos hasta la estabilización de la señal, generalmente durante menos de 10 minutos. Realice análisis de imágenes de acuerdo con el protocolo de texto.