Análisis de sinapsis inmunitarias entre células T humanas y células Raji cargadas con SEB mediante citometría de flujo por imágenes
JoVE Encyclopedia of Experiments
Inmunología
0 vistas • 4:28 min • July 8th, 2025
Tome tubos de citometría de flujo que contienen células Raji descargadas y enterotoxina B de Staphylococcus aureus o células Raji cargadas con SEB.
Estas células Raji cargadas con SEB funcionan como células B presentadoras de antígeno sustituto que contienen el superantígeno SEB complejado con moléculas MHC de clase II.
Incubar con pan-leucocitos.
Los receptores de células T, TCR en las células T se unen a los SEB en las células Raji, que, junto con las señales coestimuladoras, establecen una unión estable célula-célula, una sinapsis inmune, que conduce a la activación de las células T.
Esto desencadena vías de señalización intracelular, causando el reordenamiento del citoesqueleto de actina, con la agrupación de moléculas de señalización y receptores de superficie dentro de la sinapsis.
Después de la incubación, fije las células para preservar sus estructuras celulares. Permeabiliza las células para acceder a dianas intracelulares.
Agregue anticuerpos anti-CD3 marcados con fluoróforo, faloidina y DAPI, que se unen a CD3 en el complejo TCR, filamentos de actina y ADN, respectivamente.
Usando un citómetro de flujo de imágenes, visualice las señales fluorescentes de CD3 y actina para determinar su enriquecimiento en la sinapsis en presencia de SEB.
Comience mezclando un mililitro de sangre periférica humana recién extraída con 30 mililitros de tampón de lisis ACK en un tubo cónico de 50 mililitros. Después de ocho minutos a temperatura ambiente, llene el tubo con PBS para un lavado por centrifugación y vuelva a suspender el gránulo en dos mililitros de medio de cultivo para una incubación de 60 minutos a 37 grados centígrados.
Al final de la incubación, agregue 5 x 105 células Raji cargadas o descargadas con enterotoxina B o SEB en 500 microlitros de medio de cultivo en tubos FACS individuales, seguidos de 650 microlitros de pan-leucocitos. Gire los cocultivos y vuelva a suspender los gránulos en 150 microlitros de medio de cultivo fresco para una incubación de 45 minutos a 37 grados centígrados.
Luego, agite suavemente las células durante 10 segundos a 100 RPM mientras agrega 1,5 mililitros de paraformaldehído al 1,5%. Después de 10 minutos a temperatura ambiente, detenga la fijación con un mililitro de PBS suplementado con BSA al 1% y recoja las células por centrifugación. Vuelva a suspender los gránulos en 100 microlitros de PBS más BSA y saponina al 0,1%, y agregue las muestras de células a dos pocillos individuales de una placa de fondo en U de 96 pocillos.
Después de 15 minutos a temperatura ambiente, centrifugar la placa y volver a suspender los gránulos en 50 microlitros de PBS más BSA y saponina, que contienen los anticuerpos o compuestos conjugados con fluoróforos de interés para una incubación de 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lavar las células tres veces en 150 microlitros de PBS más BSA y saponina, y volver a suspender los gránulos en 60 microlitros de PBS.
Para obtener imágenes de las células mediante citometría de flujo, abra el software de análisis, verifique el nivel de líquido y haga clic en Iniciar en el menú del instrumento. A continuación, haga clic en Cargar y cargue las muestras en el puerto cuando se le solicite.
En la pestaña Iluminación, cambie la potencia del láser de excitación a las longitudes nanométricas adecuadas. Luego, ajuste las puertas para los canales 4 y 11, y ajuste el área para el canal 1.
Para evaluar los ajustes de compuerta y potencia del láser, cambie el menú Ver a la puerta respectiva y ajuste las puertas y las potencias del láser hasta que las celdas y los pares de celdas sean visibles. A continuación, en la pestaña Adquisición de archivos, defina el nombre de la muestra y el número de imágenes que se van a adquirir, y la puerta adecuada para la tinción de CD3, y haga clic en Adquirir para comenzar la adquisición.
Resumen
Este artículo describe un método para estudiar la activación de linfocitos T mediante células Raji cargadas con SEB como células B presentadoras de antígeno simuladas. El proceso implica citometría de flujo para visualizar la formación de la sinapsis inmunitaria y el acoplamiento del receptor de linfocitos T.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Inmunología
- Biología Celular
- Citometría de Flujo
Antecedentes
- Las células Raji pueden cargarse con superantígenos como SEB.
- La activación de linfocitos T requiere tanto el reconocimiento del antígeno como las señales coestimuladoras.
- Las sinapsis inmunitarias son fundamentales para respuestas efectivas de los linfocitos T.
- La citometría de flujo permite un análisis detallado de las interacciones celulares.
Objetivo del estudio
- Investigar los mecanismos de activación de los linfocitos T.
- Visualizar la formación de sinapsis inmunitarias.
- Evaluar el papel de SEB en el acoplamiento del receptor de linfocitos T.
Métodos Utilizados
- Preparación de células Raji cargadas y no cargadas con SEB.
- Co-cultivo de células Raji con panleucocitos.
- Fijación y permeabilización de células para tinción con anticuerpos.
- Análisis por citometría de flujo para visualizar la dinámica del TCR y de la actina.
Resultados principales
- Formación exitosa de sinapsis inmunitarias entre linfocitos T y células Raji cargadas con SEB.
- Visualización del enriquecimiento de CD3 y actina en la sinapsis.
- Demostración de las vías de señalización de activación de linfocitos T.
- Análisis cuantitativo de las respuestas de los linfocitos T al SEB.
Conclusiones
- Las células Raji cargadas con SEB imitan eficazmente a las células presentadoras de antígenos.
- La citometría de flujo es una herramienta poderosa para estudiar las interacciones de las células T.
- Comprender la dinámica de la sinapsis inmune es crucial para la investigación inmunológica.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite la evaluación cuantitativa de la formación de la sinapsis inmune, un evento temprano crítico en la activación de linfocitos T, apoyando la validación de dianas en el descubrimiento de inmunomoduladores. Al visualizar el enriquecimiento de CD3 y actina mediante citometría de flujo con imágenes, proporciona una reducción del riesgo mecanicista para biológicos que dirigen las vías de señalización del TCR. El enfoque mejora la confianza predictiva en modelos preclínicos de interacción inmune.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Analiza hipótesis de señalización dependiente del TCR mediante la visualización directa de la formación del sinapsis inmune.
- Valor científico: Apoya la validación funcional de dianas al confirmar la activación de linfocitos T dependiente de coestimulación y antígeno.
- Valor operacional: Permite la reducción de riesgos biológicos de candidatos inmunomoduladores mediante métricas cuantitativas de la sinapsis.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Prepara sistemas validados de interacción entre linfocitos T y APC para ensayos posteriores de cribado de compuestos.
- Valor operativo: Proporciona lecturas estandarizadas y reproducibles de la formación de sinapsis para la optimización de ensayos.
- Valor operativo: Facilita el uso escalable de la plataforma en la progresión de fármacos candidatos para inmunomoduladores.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Se alinea con sistemas relevantes para la enfermedad al modelar interacciones entre linfocitos T y linfocitos B humanos en vías impulsadas por superantígenos.
- Valor científico: Conecta el descubrimiento con la validación preclínica mediante la cuantificación de la dinámica de la sinapsis inmune.
- Valor estratégico: Orienta decisiones de avance ajustadas al riesgo al vincular el reclutamiento temprano del blanco con respuestas funcionales de los linfocitos T.
Integración de la Línea de Procesamiento y del Flujo de Trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la selección de interacción con el blanco hasta la optimización del fármaco líder, particularmente para inmunomoduladores y adyuvantes de vacunas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis sobre interacciones TCR-pMHC y coestimuladoras en contextos inmunitarios humanos.
- Selección: Ofrece sistemas listos para ensayos con resultados cuantitativos de imágenes para la evaluación del efecto de compuestos.
- Análisis: Proporciona métricas de enriquecimiento de CD3 y actina que permiten análisis comparativos entre diferentes condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Conecta con la continuidad preclínica mediante la modelización in vitro de la formación de sinapsis inmunitarias humanas.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable de citometría de flujo con imágenes para el perfilado inmunitario en diversas áreas terapéuticas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en la activación de linfocitos T.
- Valor operativo: Mejora la estandarización y reproducibilidad de las mediciones de sinapsis inmune entre laboratorios.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar lecturas funcionales tempranas sobre la eficacia de inmunomoduladores.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos basada en datos cuantitativos de formación de sinapsis.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en inmunología, citometría de flujo y protocolos de tinción fluorescente.
- Depende del acceso a citómetros de flujo con capacidad de imagen y controles de compensación para paneles multicolor.
- Necesita la estandarización de la preparación de células y del tiempo de incubación para una detección reproducible de sinapsis.
- Implica consideraciones de adaptación al extenderse a células inmunitarias primarias o líneas celulares relevantes para enfermedades.
- Limitado por la necesidad de co-cultivos celulares viables y condiciones óptimas de carga con SEB para obtener resultados consistentes.
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Última actualización: 22 agosto 2026