Introducción de proteínas efectoras bacterianas en células de mamíferos por electroporación

Ciertos patógenos bacterianos gramnegativos entran en contacto con las células huésped y emplean sistemas de secreción para inyectar proteínas efectoras, lo que facilita la invasión celular.

Para administrar proteínas efectoras en células de mamíferos in vitro, pipetee células de mamíferos en una cubeta refrigerada. Agregue proteínas efectoras bacterianas marcadas con péptidos de unión a estreptavidina y mezcle.

Realice la electroporación. Durante la ejecución, los pulsos eléctricos cortos interrumpen la bicapa lipídica de la membrana de la célula huésped para formar poros transitorios, lo que facilita la entrada celular de proteínas efectoras. Coloque las células en una placa de vidrio que contenga medios, permitiendo que las células se recuperen y se adhieran a la placa. Los poros se vuelven a sellar, atrapando las proteínas en su interior.

Después de la recuperación celular, fije y permeabilice las células para el acceso de anticuerpos a objetivos intracelulares. Incubar con una solución bloqueadora que contenga proteínas para evitar la unión de anticuerpos no específicos. Agregue anticuerpos primarios que se unan específicamente a la etiqueta peptídica de unión a estreptavidina