Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 2:36 min. • July 8th, 2025
Obtener un cultivo de macrófagos completamente diferenciados en una placa multipocillos. Estos macrófagos tienen marcadores de superficie, como receptores tipo toll o TLR-2, un receptor de reconocimiento de patrones que identifica varios componentes microbianos.
Agregue una cantidad adecuada de Mycobacterium tuberculosis o suspensión de células Mtb marcadas con fluorescencia en cada pocillo e incube.
TLR-2 reconoce el lipoarabinomanano, o LAM, un componente glicolípido complejo de la pared celular de Mtb, que inicia la fagocitosis. El macrófago internaliza Mtb, secuestrando la bacteria dentro de un fagosoma, un compartimento unido a la membrana.
El fagosoma madura, fusionándose con los lisosomas, formando un fagolisosoma, un compartimento ácido y rico en enzimas.
Dentro del fagolisosoma, el Mtb inhibe la bomba de protones de tipo vacuolar responsable de generar un pH ácido. En consecuencia, el pH dentro del fagolisosoma se vuelve casi neutro, desactivando las enzimas que degradan los patógenos engullidos.
La interacción entre LAM y TLR2 también afecta las vías de señalización de la célula huésped, lo que lleva a la modulación de los marcadores de superficie involucrados en la presentación de antígenos.
La inactivación del fagolisosoma y la inhibición de la respuesta inmune del huésped permiten que Mtb persista y se replique dentro del macrófago.
Para infectar las células derivadas de monocitos, diluir las bacterias a una concentración de 5 veces 10 a la sexta unidades formadoras de colonias por mililitro en medio libre de suero, y reemplazar el sobrenadante en cada pocillo de la placa de cultivo celular de seis pocillos, con 1 mililitro de medio fresco libre de suero y 1 mililitro de suspensión de bacterias por pocillo para obtener una multiplicidad de infección de 5.
Después de una incubación de 4 horas en la incubadora de cultivo celular, lave cada pocillo tres veces con 1 mililitro de tampón de lavado estéril por lavado, inclinando la placa con cuidado para eliminar todo el volumen de tampón de las esquinas de los pocillos después de cada lavado. Luego, vuelva a suspender las células derivadas de monocitos infectadas con MTb en 2 mililitros de medio completo sin antibióticos.