Un ensayo para estudiar el papel de la vitronectina en la adherencia bacteriana a las células epiteliales del huésped
JoVE Encyclopedia of Experiments
Inmunología
0 vistas • 3:53 min • July 8th, 2025
Tome una placa de pocillos múltiples que contenga monocapas de células epiteliales adheridas. Reemplace los medios con medios sin suero, evitando la interferencia de proteínas séricas. Después de la incubación, retire el medio. Lave las células con tampón. Agregue medios fríos sin suero que contengan vitronectina. Incubar a temperaturas más bajas.
El dominio RGD N-terminal de la vitronectina se une a los receptores de integrina de la superficie celular epitelial. Las temperaturas más bajas inhiben la internalización celular del complejo vitronectina-integrina.
Después de la saturación del receptor de integrina, retire el medio. Lavar con tampón para eliminar el exceso de vitronectina, lo que podría afectar la unión bacteriana de la integrina dependiente de vitronectina.
Agregue la suspensión de Haemophilus influenzae tipo f o Hif, un patógeno bacteriano gramnegativo. Incubar.
La proteína H en la superficie de Hif se une al extremo C de la vitronectina, lo que facilita la adherencia de Hif a la célula epitelial y la posterior internalización.
Retire el medio y lave con tampón para eliminar el Hif no unido. Use una enzima de desprendimiento celular para recolectar las células. Agregue medios que contengan suero para detener la reacción enzimática. Transfiera la suspensión celular a un tubo de vidrio que contenga perlas de vidrio. Vórtice para lisar las células, liberando bacterias internalizadas y adheridas a la superficie.
Diluir el lisado con medios sin suero y semillas en una placa de agar de chocolate. Incubar para que Hif forme colonias. Cuente las colonias.
Un mayor número de colonias indica una mayor adherencia de Hif a las células epiteliales en presencia de vitronectina.
Cultive células epiteliales A549 como se describe en el protocolo de texto. Después de un lavado y tripsinización de las células a 37 grados Celsius, diluya la suspensión celular a 5,000 células por mililitro usando un medio completo que contenga 5 microgramos por mililitro de gentamicina.
Antes de la infección bacteriana, reemplace el medio en los pocillos con medio F12 e incube durante la noche a 37 grados centígrados. Lave la monocapa celular tres veces con 1 mililitro de PBS a temperatura ambiente. Luego, coloque la placa sobre hielo y agregue 200 microlitros de medio F12 preenfriado, que contiene 10 microgramos por mililitro de vitronectina.
Después de incubar la placa a 4 grados centígrados durante 1 hora, deseche la solución pipeteando y lave la capa celular dos veces con 1 mililitro de PBS a temperatura ambiente. Agregue 100 microlitros de Hif wild-type recién cultivado en medio F12 a cada pocillo. Incube la placa durante 2 horas a 37 grados centígrados. Luego aspire el medio con una pipeta y lave las células epiteliales A549 tres veces con PBS a 50 microlitros por pocillo de solución de desprendimiento celular y siga con una incubación de 5 minutos a 37 grados Celsius.
A continuación, agregue 50 microlitros de medio completo F12 por pocillo para detener la reacción enzimática. Transfiera las células epiteliales de cada pocillo a un tubo de vidrio de 6 mililitros que contenga 4 perlas de vidrio. Lisar las células a temperatura ambiente mediante un vórtice durante 2 minutos.
Después de diluir el lisado celular 100 veces, coloque 10 microlitros de la muestra diluida en una placa de agar de chocolate. Cuente las colonias después de una incubación nocturna a 37 grados centígrados.
Descripción general
Este estudio investiga la adherencia de Haemophilus influenzae tipo f (Hif) a células epiteliales mediada por vitronectina. El protocolo describe los pasos para preparar monocapas de células epiteliales y evaluar la adherencia bacteriana mediante el recuento de colonias.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Microbiología
- Biología Celular
- Mecanismos de Infección
Antecedentes
- Haemophilus influenzae tipo f es un patógeno bacteriano gramnegativo.
- La vitronectina es una glicoproteína que desempeña un papel en la adhesión celular.
- Los receptores de integrina en las células epiteliales son cruciales para la adherencia bacteriana.
- La temperatura puede influir en la internalización de los complejos vitronectina-integrina.
Objetivo del estudio
- Evaluar el papel de la vitronectina en el aumento de la adherencia de Hif a las células epiteliales.
- Establecer un protocolo para medir cuantitativamente la adherencia bacteriana.
- Comprender la interacción entre las proteínas bacterianas y los receptores de las células huésped.
Métodos Utilizados
- Preparación de monocapas de células epiteliales en placas de múltiples pocillos.
- Incubación con vitronectina a bajas temperaturas para evitar la internalización.
- Infección de las células con Hif y lavado posterior para eliminar bacterias no unidas.
- Recuento de colonias en placas de agar chocolate para evaluar los niveles de adherencia.
Resultados principales
- Se observó un aumento en la adherencia de Hif a las células epiteliales en presencia de vitronectina.
- La manipulación de la temperatura inhibió eficazmente la internalización del complejo vitronectina-integrina.
- Los recuentos de colonias indicaron una correlación directa entre la concentración de vitronectina y la adherencia bacteriana.
Conclusiones
- La vitronectina mejora significativamente la adherencia de Hif a las células epiteliales.
- Comprender esta interacción podría orientar estrategias para combatir infecciones bacterianas.
- El protocolo establecido puede utilizarse para estudios adicionales sobre los mecanismos de adherencia bacteriana.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este ensayo permite la evaluación cuantitativa de las interacciones huésped-patógeno mediante la medición de la adherencia bacteriana a células epiteliales a través de mecanismos mediados por vitronectina. Apoya la validación de dianas en el descubrimiento de agentes antiinfecciosos al reducir los riesgos asociados a hipótesis mecanicistas sobre las vías de adhesión. El método proporciona una confianza predictiva para priorizar compuestos o biológicos que interrumpan la unión huésped-patógeno.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Evalúa la hipótesis terapéutica de que la vitronectina mejora la adherencia de patógenos bacterianos a las células hospedadoras.
- Valor operativo: Clarifica el papel de los receptores integrinas del hospedador en las vías de internalización de patógenos.
- Valor científico: Apoya la validación funcional del blanco al vincular la unión vitronectina-integrina con la eficiencia de colonización bacteriana.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Prepara modelos estandarizados de células epiteliales para la evaluación reproducible de la adhesión bacteriana.
- Valor operativo: Permite obtener lecturas cuantitativas de unidades formadoras de colonias para el cribado de inhibidores de la adhesión.
- Valor científico: Facilita la escalabilidad del ensayo mediante una concentración definida de vitronectina y pasos de incubación controlados por temperatura.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Utiliza células epiteliales A549 relevantes para la enfermedad para modelar las interacciones con patógenos respiratorios.
- Valor operativo: Proporciona continuidad desde el compromiso del blanco hasta los resultados funcionales de adherencia en modelos preclínicos.
- Valor científico: Apoya el avance ajustado al riesgo mediante la cuantificación de la reducción de la adherencia como biomarcador de la actividad anti-virulencia.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El ensayo se integra en la fase temprana del descubrimiento, aportando información para la identificación de compuestos activos mediante la medición de las interacciones patógeno-huésped mediadas por el objetivo antes de las pruebas de eficacia preclínicas.
- Biología del Descubrimiento: Evalúa hipótesis mecanicistas sobre el papel de la vitronectina en la facilitación de la adherencia bacteriana y la internalización.
- Detección: Proporciona datos cuantitativos y reproducibles de adherencia mediante el recuento de UFC para comparar condiciones con inhibidores.
- Análisis: Genera lecturas del recuento de colonias que permiten la comparación estadística de los niveles de adherencia entre grupos experimentales.
- Investigación Traducional: Conecta los mecanismos moleculares de adhesión con la continuidad preclínica utilizando modelos epiteliales clínicamente relevantes.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para estudiar patógenos diversos que aprovechan las proteínas de la matriz extracelular del huésped para adherirse.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad en los mecanismos de adhesión huésped-patógeno.
- Valor operativo: Estandariza la evaluación de la adhesión mediante dosis definidas de vitronectina, control de temperatura y pasos de lavado.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance/no avance al identificar compuestos que bloquean la adhesión mediada por virulencia en fases tempranas del descubrimiento.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de terapéuticos antiadhesión basada en datos cuantitativos de inhibición de la adhesión.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el mantenimiento de cultivos celulares y en el manejo de patógenos bajo condiciones de bioseguridad.
- Depende del acceso a lectores de placas de múltiples pocillos, centrífugas e incubadoras anaeróbicas o con CO2 para el crecimiento bacteriano.
- Necesita la estandarización de la fuente y concentración de vitronectina entre laboratorios para obtener resultados reproducibles.
- Incluye consideraciones de adaptación al extender el ensayo a tipos celulares epiteliales o endoteliales no respiratorios.
- Comprende limitaciones prácticas, como la variabilidad potencial en la expresión de factores de virulencia bacteriana que afectan las mediciones de adherencia.
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Última actualización: 29 agosto 2026