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Inmunología
0 vistas • 4:51 min • July 8th, 2025
Coloque la mucosa uterina cervical en una placa de Petri. Separe la mucosa del ectocérvix y el endocérvix de la submucosa. Corta la capa mucosa en explantes más pequeños y transfiérelos a un tubo cónico.
Agregue el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 o VIH-1 en el tubo de explante. Las partículas del virus VIH-1 se acercan a la capa mucosa expuesta y se unen al receptor CD4 y al correceptor CXCR4 en la célula huésped.
Al unirse, la envoltura viral se fusiona con la membrana de la célula huésped, liberando una cápside viral que contiene ARN viral y enzima transcriptasa inversa en el citoplasma. Dentro del citoplasma, la transcriptasa inversa convierte el ARN viral en ADN complementario o ADNc.
El ADNc se mueve hacia el núcleo de la célula huésped, donde la integrasa incorpora ADN viral en el genoma del huésped. El ADN viral dirige la síntesis de nuevo ARN viral y proteínas que se ensamblan en nuevas partículas de virus. Estas partículas brotan de la célula huésped, adquiriendo una envoltura lipídica.
Enjuague los explantes con un tampón adecuado para eliminar cualquier virus no unido. Finalmente, coloque los explantes en una esponja de gelatina en una placa multipocillo con un medio adecuado e incube.
La interfaz aire-líquido maximiza la exposición al oxígeno y la accesibilidad a los nutrientes a través de los capilares de la esponja, lo que mejora la viabilidad del modelo para el análisis posterior.
Use la tapa de la placa de Petri como superficie de corte para diseccionar el tejido. Sujetando el tejido suavemente con fórceps, separe la mucosa del ectocérvix y/o endocérvix del estroma y submucosa inferior con un bisturí y una cuchilla para obtener tiras de mucosa. Corta la mucosa en tiras de 2 milímetros de ancho. Retire y deseche la mayor cantidad posible de submucosa, dejando solo una capa de tejido de 2 milímetros de espesor. Luego, corta las tiras en bloques de 2 milímetros de grosor.
Transfiera los explantes de tejido a una nueva placa de Petri de 100 milímetros que contenga de 10 a 20 mililitros de CMT para evitar la desecación del tejido mientras se procede con la disección. Al final de la disección, gire la placa para aleatorizar la distribución del explante. Con pinzas estériles, transfiera los explantes a tubos cónicos estériles de 1,5 mililitros. Retire cualquier medio del tubo con una pipeta.
Para obtener resultados óptimos, los explantes de cuello uterino deben procesarse e infectarse lo antes posible después de la cirugía, idealmente el día de la cirugía. Alternativamente, los tejidos pueden almacenarse sumergidos en CMT a 4 grados durante la noche e infectarse inmediatamente después de la disección.
Descongele la preparación de VIH-1 en un baño de agua a 37 grados centígrados. Una vez descongelado, transfiera el virus a los tubos que contienen los explantes. Transfiera los tubos a un termoagitador e incube durante dos horas a 37 grados centígrados, balanceándose a 300 RPM. Invierta suavemente los tubos varias veces cada 30 a 60 minutos.
Mientras tanto, llene una placa de seis pocillos con 3 a 4 mililitros por pocillo de solución salina estéril tamponada con fosfato. Al final de la incubación con VIH-1, use una pipeta para desechar toda la preparación del virus en los tubos que contienen los explantes en un recipiente con solución desinfectante. Luego, use fórceps y una pipeta para transferir los explantes a la placa de seis pocillos que contiene PBS.
Después de dejar reposar los explantes en PBS durante un minuto a temperatura ambiente, lávelos pipeteando suavemente el PBS hacia arriba y hacia abajo en el pocillo dos o tres veces. A continuación, deseche el PBS en un recipiente con solución desinfectante con una pipeta. Agregue de 3 a 4 mililitros de PBS nuevo a cada pocillo. Repita dos veces más para un total de tres lavados. Deseche el PBS justo antes de transferir los explantes a las esponjas para evitar la desecación del tejido.
Ahora, use fórceps para transferir de cinco a ocho explantes encima de cada bizcocho de gelatina en una placa de 12 pocillos. Regrese la placa a la incubadora.