Una técnica para la generación de partículas similares al virus de la gripe a través de un sistema de mamíferos

Las partículas similares a los virus, o VLP, imitan la estructura del virus pero carecen de material genético viral, lo que las hace no virulentas. Las VLP poseen epítopos antigénicos unidos a la superficie reconocidos por las células inmunitarias, lo que los convierte en candidatos ideales para vacunas.

Para generar VLP de influenza recombinante, tome vectores de expresión eucariota.

Dos vectores contienen genes que codifican la hemaglutinina, o HA, y la neuraminidasa, o NA, proteínas estructurales del virus de la influenza. El tercer vector contiene el gen gag, que codifica proteínas centrales del virus de la inmunodeficiencia humana.

Agregue un reactivo de transfección a base de lípidos catiónicos. El grupo de cabeza lipídica cargado positivamente interactúa con el ADN cargado negativamente, formando una bicapa alrededor de los vectores, generando complejos de transfección de liposomas.

Agregue complejos a células huésped de mamíferos cultivadas adecuadas para la producción de VLP e incube. Los complejos de transfección ingresan a las células a través de la endocitosis: la membrana del liposoma se fusiona con la membrana del endosoma para liberar los vectores en el citoplasma.

Los vectores ingresan al núcleo, lo que lleva a la expresión de los genes virales. Tras la síntesis de HA y NA en el retículo endoplásmico, las proteínas se translocan a la membrana plasmática a través de la vía secretora.

Las proteínas centrales se sintetizan en el citoplasma y se transportan al sitio de ensamblaje para anclarse en la membrana plasmática. Los componentes virales acumulados se autoensamblan en VLP y brotan de la célula huésped.

Recolecte las VLP liberadas para el procesamiento posterior.

El día de la transfección, prepare soluciones de liposomas y ADN según las recomendaciones del fabricante. Transfecte las células de ADN con una composición de ADN de 1:1:2 de HA:NA:Gag y una cantidad total de ADN de 40 microgramos por matraz T-150. Repita este paso para crear nueve matraces T-150 para un volumen total de 200 mililitros.

A continuación, diluya el ADN y las soluciones liposomales en medios de transfección sin suero sin antibióticos para que cada matraz contenga un volumen total de 24 mililitros. Regrese los matraces a la incubadora y mantenga las células en medio de cultivo de transfección hasta el día de la recolección de partículas similares a virus o VLP.

Transfiera el sobrenadante a tubos cónicos de 15 mililitros para recolectar el cultivo de las células después de 72 a 96 horas después de la transfección. Gire las células hacia abajo para granular los desechos celulares. Recoja los sobrenadantes y fíltrelos a través de una membrana de poros de 0,22 micras.