Microscopía intravital para analizar las interacciones entre células sanguíneas y endoteliales en un modelo de ratón con inflamación

Comience con un ratón anestesiado al que se le haya inyectado lipopolisacárido por vía intraperitoneal para inducir la inflamación.

Incidir el abdomen para exponer la cavidad abdominal. Mantenga la hidratación de los órganos con solución salina. Inyecte rodamina 6G retroorbitalmente. Las moléculas de colorante fluorescente entran en la circulación y marcan leucocitos y plaquetas para su visualización.

Ahora, exterioriza un asa de íleon con sus vasos mesenteriosos. Mantenga el tejido hidratado con solución salina precalentada para obtener imágenes óptimas. Bajo un microscopio de fluorescencia, enfoque una vena de mesenterio para microscopía intravital.

La inyección de lipopolisacáridos provoca la activación de las células endoteliales con la regulación positiva de las moléculas de adhesión, incluidas las selectinas. Las plaquetas circulantes se reclutan en el endotelio, donde se unen a través de interacciones específicas molécula-ligando de adhesión, formando complejos de adhesión.

Debido a estas interacciones, las plaquetas se activan y liberan gránulos que contienen moléculas, incluida la serotonina, lo que promueve el reclutamiento de leucocitos.

Los leucocitos se mueven hacia la superficie endotelial y se unen a las plaquetas activadas. Además, los leucocitos ruedan a lo largo del endotelio y se unen a las células endoteliales a través de interacciones adhesivas débiles. El movimiento de balanceo activa las integrinas leucocitarias para una adhesión firme a las células endoteliales, crucial para la transmigración leucocitario-endotelial.

Usando microscopía intravital, visualice los leucocitos fluorescentes y las plaquetas para determinar sus interacciones en tiempo real con las células endoteliales.

Cuatro horas antes de la imagen intravital, inyecte 20 miligramos por kilogramo de LPS IP en un ratón macho de 16 a 20 gramos de 4 a 6 semanas de edad para inducir la respuesta inflamatoria bacteriana simulada.

Precaliente una solución salina al 0,9% en un baño de agua a 37 grados Celsius para humedecer la cámara de plástico y el tejido mesenterio también en este momento. A continuación, confirme la profundidad adecuada de la anestesia por falta de respuesta al pellizco del dedo del pie en el ratón tratado con LPS y luego aplique ungüento en los ojos del animal.

Depile el abdomen con una afeitadora, eliminando el vello suelto con una gasa empapada en etanol al 70%. Luego, use unas pequeñas pinzas curvas y unas tijeras para abrir el abdomen.

Identifique los vasos epigástricos y abra el peritoneo en la región de la línea alba para proteger los vasos. Aplique unas gotas de solución salina precalentada en la cavidad abdominal para mantener el tejido húmedo, seguido de una inyección retroorbitaria de 50 microlitros de rodamina 6G para etiquetar las células sanguíneas circulantes. Luego, coloque el ratón en una placa de Petri de 10 centímetros, exteriorice un asa de íleon y administre la solución salina precalentada cada dos minutos para mantener el tejido húmedo.

Para visualizar la respuesta inflamatoria por microscopía intravital, coloque el ratón debajo del microscopio y coloque una vena de mesenterio con un diámetro de 200 a 300 micrómetros y la menor cantidad posible de grasa circundante visible en el campo de visión.

Usando el software de microscopio apropiado, registre las interacciones entre células sanguíneas y endoteliales durante 1 minuto en 4 venas diferentes por ratón. Luego, para analizar las respuestas de célula a célula, confirme las condiciones de flujo sanguíneo estables e interindividuales.

Para cuantificar el número de leucocitos rodantes, dibuje una línea vertical a través de la vena y cuente manualmente todos los leucocitos que cruzan esta línea en 1 minuto. Para determinar la velocidad de rodadura, dibuje dos líneas verticales a través de la vena a 50 micrómetros de distancia y mida el tiempo que tarda un solo leucocito en cruzar entre las líneas mientras rueda de manera estable sobre el endotelio.

Para medir la adhesión de los leucocitos, dibuje un cuadrado de 200 por 200 micrómetros en la vena. Luego, cuente manualmente los leucocitos firmemente adheridos que no exhiben ningún movimiento visible dentro del cuadrado durante 30 segundos. Finalmente, para cuantificar las interacciones plaqueta-leucocitos, cuente manualmente el número de plaquetas unidas a un leucocitos.