Una técnica para establecer un modelo de infección bacteriana en larvas de insectos

Coloque una larva de Galleria mellonella, la polilla de la cera mayor, en una plataforma de inyección, exponiendo el lado ventral.

Tome una microjeringa que contenga una suspensión de Mycobacterium bovis BCG lux, una cepa de vacuna bacteriana viva modificada genéticamente para producir bioluminiscencia. Inyecte la suspensión en la última pierna o apéndices abdominales, liberando bacterias en la hemolinfa, líquido circulatorio en la cavidad corporal.

Transfiera la larva a un ambiente controlado e incube. Las bacterias utilizan la hemolinfa como una rica fuente de nutrientes y se multiplican.

Los hemocitos, células inmunitarias de invertebrados en la hemolinfa, se agrupan alrededor de la bacteria, formando una estructura similar a un granuloma para evitar la propagación de infecciones. Los hemocitos liberan profenoloxidasa, que se somete a una escisión proteolítica para formar fenoloxidasa.

La fenoloxidasa sintetiza melanina que secuestra las bacterias en el sitio de la infección. La deposición de pigmento de melanina provoca melanización sistémica, oscureciendo el color de las larvas.

Los hemocitos envuelven las bacterias en fagosomas. Los fagosomas se fusionan con los lisosomas para adquirir enzimas líticas, causando la degradación bacteriana. Un subconjunto de bacterias puede evadir la degradación fagolisosomal y residir en los hemocitos, lo que lleva a una infección persistente.

Mida la bioluminiscencia bacteriana a intervalos definidos. Una disminución inicial de la bioluminiscencia indica una respuesta antibacteriana eficaz, mientras que la meseta del valor indica una infección persistente.

Mantenga las larvas de estadio compradas en la oscuridad a 18 grados centígrados a su llegada y utilícelas dentro de una semana de la compra. Identifique y seleccione larvas sanas para la experimentación en función del color crema uniforme, el tamaño y el peso apropiados, la alta motilidad y la capacidad de enderezarse cuando se les da la vuelta. Con unas pinzas romas, cuente cuidadosamente las larvas sanas en una placa de Petri forrada con una capa de papel de filtro y guárdelas a temperatura ambiente en la oscuridad hasta su uso.

Prepare la plataforma de inyección pegando un papel de filtro circular de 94 milímetros de diámetro a una superficie plana y elevada. Aspire tres volúmenes de etanol al 70% en una microjeringa de 25 microlitros para esterilizar, desechar y enjuagar con tres volúmenes de PBST estéril. Luego, vuelva a suspender el inóculo BCG lux preparado y aspire 10 microlitros en la microjeringa esterilizada. Use una jeringa separada para aspirar PBST para un control negativo.

Después de 10 inyecciones, vuelva a suspender el inóculo de BCG lux para garantizar una suspensión celular uniforme. Use pinzas para recoger una larva y colocarla en la plataforma de inyección. En la plataforma, voltee la larva sobre su espalda e inmovilice asegurando la cabeza y la cola con las pinzas. Localice la última proleg izquierda en cuenta regresiva desde la cabeza de la larva e inserte con cuidado la punta de la aguja de 5 a 6 mm de profundidad en un ángulo de 10 a 20 grados con respecto al plano horizontal. Inyecte el inóculo de la jeringa.

Después de cada infección, transfiera la larva infectada a una placa de Petri forrada con una capa de papel de filtro. Una sola placa de Petri de 94 milímetros puede acomodar hasta 30 larvas. Guarde la placa de Petri en una caja oscura ventilada dentro de una incubadora a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono.

Controla la supervivencia de las larvas cada 24 horas. Las larvas se consideran muertas cuando no se mueven en respuesta al tacto. Registre la supervivencia y evalúe la significación estadística con una prueba de Mantel-Cox.