Un modelo de ratón con bolsa de aire para la recolección de exudado inflamatorio inducido por lipopolisacáridos

Coloque un ratón anestesiado en la almohadilla quirúrgica estéril conectada a una unidad de respiración con un flujo continuo de oxígeno y un gas anestésico.

Con un filtro, cargue la jeringa con aire estéril. Coloque una aguja en la jeringa e inyecte aire esterilizado por vía subcutánea en la parte posterior del ratón para crear una bolsa de aire dentro de las capas de tejido. Supervise el mouse hasta la recuperación.

Vuelva a anestesiar al ratón y administre lipopolisacárido, LPS, en la bolsa de aire. LPS se une al receptor tipo toll 4, TLR-4 en los macrófagos residentes en el tejido y las células dendríticas, activándolos.

Las células activadas liberan varios mediadores inflamatorios como citoquinas y quimiocinas, que atraen neutrófilos y otras células inmunitarias. Estos mediadores también aumentan la permeabilidad vascular de los vasos sanguíneos cercanos, lo que permite que las células inmunitarias y los factores solubles entren en la bolsa de aire desde el torrente sanguíneo.

A medida que el líquido se acumula dentro de la bolsa, forma un exudado que comprende células inflamatorias y varias moléculas bioactivas.

Eutanasia al ratón e inyecte un tampón de lavado adecuado en la bolsa de aire. Recoja el exudado inflamatorio en un tubo de microcentrífuga y centrifugue. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en el tampón de lavado.

Analizar el exudado inflamatorio para cuantificar la proporción de neutrófilos y determinar el alcance de su infiltración.

Después de anestesiar a los ratones el día cero, use un filtro de 0,22 micras conectado a una jeringa de cinco mililitros para obtener un volumen de tres mililitros de aire esterilizado. Levante la piel posterior del ratón anestesiado con pinzas y use subcutáneamente una aguja de calibre 26 por 3/8 de pulgada para inyectar tres mililitros de aire esterilizado.

Después del tratamiento, retire los ratones de la unidad respiratoria y colóquelos en una jaula bien colocada. Monitoree a los ratones para asegurarse de que estén vivos hasta que comiencen a moverse. El tercer día, inyecte tres mililitros adicionales de aire esterilizado en la bolsa de aire previamente establecida para mantener la bolsa de aire.

El sexto día, inyecte diferentes tratamientos en la bolsa de aire. Inyecte un mililitro de PBS como control negativo e inyecte un mililitro de un microgramo por mililitro de LPS como control positivo para inducir inflamación local. Después de seis horas, sacrifique a los ratones.

Para cada bolsa de aire, inyecte un mililitro de tampón de lavado para lavar la bolsa de aire y recoger el exudado inflamatorio en un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Luego, lave la bolsa de aire con dos mililitros de tampón de lavado dos veces y recoja el exudado inflamatorio en el mismo tubo de centrífuga.

Centrifugar a 100 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en un mililitro de tampón de lavado. Cuente las células para cuantificar la proporción de neutrófilos, utilizando el analizador automático de hematología.