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Para cuantificar la infiltración de células inmunitarias en el tejido de la vejiga de ratón infectado con E. coli uropatógeno, coloque el tejido picado en un tampón de digestión que contenga colagenasa y desoxirribonucleasa.
Incube agitando regularmente para alterar el tejido.
La colagenasa digiere la matriz extracelular del tejido, liberando células. La desoxirribonucleasa degrada el ADN libre que interfiere.
Después de la incubación, agregue tampón con un agente quelante y suero bovino fetal para inactivar las enzimas digestivas.
Pasar la mezcla digerida por un colador para eliminar los restos de tejido y tejido conectivo, obteniendo una suspensión unicelular.
Centrifugar y resuspender las células en un tampón que contenga anticuerpos bloqueadores de Fc. Estos anticuerpos se unen a los receptores Fc de las células inmunitarias para evitar la unión de anticuerpos no específicos.
Agregue anticuerpos anti-CD45 marcados con fluoróforos, que se unen a la proteína CD45 transmembrana en las células inmunitarias.
Centrifugar y pasar las células resuspendidas a través de un filtro celular para eliminar los agregados celulares.
Usando un citómetro de flujo, mida las señales de fluorescencia de los anticuerpos conjugados con fluoróforos en las células inmunitarias para cuantificar la infiltración de células inmunitarias en la vejiga.
Para realizar la citometría de flujo en el tejido de la vejiga, después de aislar la vejiga como se demostró, use tijeras para picar bien el tejido. Agregue 1 vejiga picada por tubo que contenga tampón de digestión, luego, agite el tubo para lavar el tejido picado en el tampón de digestión y manténgalo en hielo hasta que todas las vejigas estén disecadas y picadas. Incube las vejigas picadas a 37 grados centígrados durante 60 a 75 minutos agitando vigorosamente a mano durante 5 segundos cada 15 minutos.
Cuando el tejido tiene una apariencia vidriosa y transparente que se asemeja al papel de seda húmedo, la digestión es completa. Inactive las enzimas de digestión agregando de 2 a 3 mililitros de tampón de citometría de flujo helado y mezcle suavemente. Luego, coloque los tubos en hielo.
Para asegurar una suspensión unicelular y eliminar cualquier tejido conectivo, pase el contenido del tubo a través de un filtro de 100 micrómetros colocado en un tubo cónico de 15 mililitros. Luego, con el extremo de un émbolo de jeringa, presione suavemente cualquier tejido restante a través del filtro. Lave el filtro con 2 mililitros adicionales de tampón de citometría de flujo y mantenga las muestras en hielo. A continuación, lavar las muestras por centrifugación a 200 veces g a 4 grados centígrados durante 7 minutos.
Vuelva a suspender el sedimento en 100 microlitros de tampón de citometría de flujo que contenga un bloque de Fc diluido a 5 microgramos por mililitro y transfiéralo a una placa de fondo redondo de 96 pocillos. Después de 10 a 15 minutos, agregue 100 microlitros del cóctel de anticuerpos deseado a cada muestra. Luego, incube las muestras en hielo, protegidas de la luz, durante 30 a 45 minutos. Lavar las muestras por centrifugación a 200 veces g en 4 grados centígrados durante 7 minutos.
Finalmente, vuelva a suspender los gránulos celulares en 200 microlitros de tampón de citometría de flujo y pase las muestras a través de un filtro celular de 40 micrómetros en un tubo de poliestireno de 5 mililitros justo antes de la adquisición en un citómetro de flujo.