Una técnica para establecer un modelo de infección bacteriana en un cultivo de órganos ex vivo

Tomemos un cultivo de órganos placentarios humanos cultivados en una matriz extracelular o ECM.

El cultivo exhibe una estructura similar a vellosidades con un sincitio externo, una capa trofoblástica multinucleada, y citotrofoblastos subyacentes, o CBT, que se diferencian en trofoblastos extravellosos, o EVT, que se anclan en la ECM.

Introducir Listeria monocytogenes, una bacteria patógena.

Las internalinas, las proteínas de la superficie bacteriana, se unen a los receptores EVT, lo que facilita la internalización bacteriana a través de la endocitosis.

Las bacterias internalizadas secretan toxinas formadoras de poros y fosfolipasas que perforan la membrana vacuolar, mediando su ruptura y escape bacteriano al citoplasma.

Las bacterias escapadas reclutan maquinaria huésped para la polimerización de actina, impulsándolas hacia la membrana de la célula huésped.

La secreción de un factor de virulencia bacteriana induce la formación de protuberancias en la membrana del huésped. Las células vecinas engullen la protuberancia que contiene bacterias, lo que provoca la propagación de la infección.

La bacteria se propaga a través de EVT a las CBT subyacentes.

Agregue un antibiótico para eliminar las bacterias extracelulares, preparando el modelo de infección para el análisis.

Antes de comenzar la infección, inocular una sola colonia de L. monocytogenes de una placa de agar de infusión cerebro-corazón rayada en 3 mililitros de caldo de infusión cerebro-corazón. Incube el cultivo durante la noche en una posición inclinada a 30 grados centígrados para permitir que el crecimiento bacteriano alcance una fase estacionaria.

A la mañana siguiente, use pinzas estériles para eliminar cualquier pieza de cultivo de órganos flotantes que no invadió la matriz extracelular y aspire cuidadosamente el medio desde el fondo de cada transpozo. A continuación, pipetee suavemente 1 mililitro de PBS tibio en los transpozos superior e inferior dos veces, retirando cada lavado con una aspiración cuidadosa.

Después del segundo lavado, pipetee suavemente 1 mililitro del medio apropiado en los transpozos superior e inferior teniendo cuidado de no perturbar los cultivos de órganos y devuelva los cultivos a la incubadora durante una hora.

Al final de la incubación, reemplace el medio en la parte superior de los transpocillos con 1 mililitro de inóculo y vuelva a colocar las placas en la incubadora de cultivo celular para facilitar la invasión bacteriana, reemplazando todo el medio en cada pocillo diariamente.