Intraespinal trasplante de células de Orientación asta ventral del cuello uterino en la esclerosis lateral amiotrófica y la lesión de la médula espinal

El trasplante de precursores neuronales es una estrategia prometedora para la protección y / o reemplazar la pérdida / disfuncional neuronas cervical motor frénico en lesiones de médula espinal (LME) y el trastorno de la neurona motora, esclerosis amiotrófica laterales (ALS). Ofrecemos un protocolo para la entrega de celulares a cuerno ventral de la médula espinal cervical en modelos de roedores de la ELA y la médula espinal.

El objetivo general de este procedimiento es dirigirse al trasplante intraespinal segmentario múltiple de células precursoras neurales a la médula espinal cervical, materia gris ventral de ratas y ratones. Esto se logra preparando primero el tipo de célula precursora neural de interés para el trasplante. Luego, se realiza una laminectomía en la médula espinal en cada punto del trasplante de células previsto.

Las células Next se inyectan correctamente en los lugares y profundidades apropiados para dirigir con precisión la entrega de células al asta ventral de la médula espinal cervical. El paso final es continuar administrando inmunosupresión al animal hasta el sacrificio para lograr la supervivencia de las células trasplantadas en la médula espinal. En última instancia, se pueden obtener resultados para rastrear la supervivencia, la migración y la diferenciación de las células precursoras neurales trasplantadas en la médula espinal cervical adulta en varios puntos temporales después del trasplante a través de métodos histológicos como la inmunohistoquímica y el análisis microscópico posterior.

La demostración visual en este método es fundamental, ya que muchos de los intrincados pasos quirúrgicos y de trasplante de células de la médula espinal son difíciles de aprender porque requieren mucho cuidado y técnicas específicas, y se facilitan. Si se emplean estos procedimientos recomendados Tres días antes del trasplante, inmunosuprimir al animal mediante la administración de inyecciones diarias de 10 miligramos por kilogramo de peso corporal, ciclosporina A mediante inyección subcutánea. Si se van a trasplantar células derivadas de roedores, o un miligramo por kilogramo de peso corporal de FK 5 0 6 y rapamicina por inyección intraperitoneal.

Si se van a trasplantar células derivadas de humanos, también se deben dar forma a clips resistentes para formar retractores. Rompe parte del clip para hacer un gancho y dobla el otro extremo del clip en un pequeño bucle. A continuación, ate una cuerda a través del lazo de cada retractor, autoclave, los retractores y todos los instrumentos que se utilizarán en la cirugía el día de la cirugía.

Preparar alícuotas de células progenitoras gliales u otras células para ser trasplantadas de acuerdo con los procedimientos descritos en el protocolo escrito. Una vez recolectadas las células, distribuya las suspensiones celulares entre múltiples tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros y manténgalas en hielo húmedo. Luego, después de administrar un método apropiado de anestesia al animal, confirme que se ha logrado un tratamiento anestésico adecuado para la cirugía mediante la realización de un pellizco en el dedo del pie.

Usando una maquinilla de afeitar eléctrica para afeitar la espalda del animal, el pelo desde un área ligeramente rostral hasta las orejas hasta la mitad de la espalda del animal, afeita bien y retira el pelo cortado de la piel para evitar que el pelo entre en la incisión. A continuación, empapa un trozo de gasa con solución antiséptica de povidona yodada y aplícala sobre la piel sobre la zona afeitada. Frote al menos dos veces con la solución antiséptica y dos veces con alcohol o desinfectante diluido de manera circular.

Comenzando en el sitio de la incisión y yendo hacia afuera hacia la línea del cabello. Coloque una almohadilla de gasa enrollada estéril sobre una tabla de cirugía limpia y pegue la almohadilla a la tabla para que no se mueva. Coloque el animal encima de la gasa enrollada en posición de ciruela pasa.

Estire ambos brazos del animal en la almohadilla y luego pegue los brazos con cinta adhesiva a la almohadilla y a la tabla de cirugía para sostener la médula espinal cervical. Esto hará que sea más fácil trabajar durante toda la cirugía, ya que el cordón cervical se encuentra profundamente debajo de la superficie de la piel. Se debe usar un paño quirúrgico estéril durante este procedimiento, aunque esto no se muestra en el video con fines de demostración.

Primero, mientras observa a través de un microscopio quirúrgico configurado con el aumento más bajo, use un bisturí estéril afilado para hacer una incisión en la línea media desde la base del cráneo hasta la escápula. Luego haga una incisión a través de las tres capas musculares sobre la columna vertebral. Use suficiente presión para cortar todas las capas musculares con el mínimo número de cortes, pero no presione con demasiada firmeza, ya que esto puede causar daño en los tejidos más profundos con dos aplicadores con punta de algodón.

Use un movimiento de torsión para separar el músculo suprayacente del músculo paraespinal. No corte ni desgarre el músculo, ya que esto causará hemorragia. Coloque cuatro de los retractores caseros en posición para retraer el músculo.

A continuación, tire de cada uno de los cuatro retractores hacia las cuatro esquinas y pegue las cuerdas a la tabla para asegurar el retractor. La exposición final debe ser cuadrada o rectangular. Use pinzas dentadas de rata y tijeras de resorte de tamaño mediano para quitar el músculo paraespinal de la superficie dorsal de las vértebras.

Tome los cortes muy cerca del hueso para exponer mejor la superficie del hueso. Asegúrese de que los cortes sean paralelos a la superficie de las vértebras, pero no corte hacia abajo en el cordón. Cambie las tijeras de resorte de tamaño mediano por una reja sin procesar.

A continuación, asegure toda la columna vertebral agarrando el músculo sobre el proceso C dos con las pinzas de dientes de rata y utilice la ella cruda para separar el músculo en el nivel C cuatro, C cinco y C seis. A continuación, comience una laminectomía en C cinco. Nuevamente, asegure el área sosteniendo C dos con pinzas de dientes de rata.

Agarre toda la lámina con la hembra en bruto y coloque la reja en bruto de modo que la herramienta quede completamente perpendicular al eje de la columna vertebral. Triture lenta y suavemente la lámina sin empujar hacia abajo en la médula espinal. A continuación, tire suavemente del trozo de hueso roto hacia arriba.

A continuación, coloque el ger crudo perpendicular a la columna vertebral. A continuación, inserte suavemente el ger crudo debajo del hueso con un ángulo de 30 a 60 grados en relación con la superficie del cordón. Haga pequeños cortes para extender la laminectomía a todas las láminas de C cuatro a C seis.

No extienda la laminectomía demasiado lateralmente, ya que esto causará hemorragia. Aumente el aumento del microscopio a alrededor de 15x y concéntrese en el cable. Úsalo recto y afilado.

Número cinco pinzas para limpiar el tejido conectivo en la parte superior de la duramadre. A continuación, utilice unas mini tijeras de muelle o un microbisturí para incidir la duramadre paralela al eje de la columna vertebral. Como un punto justo medial a la zona de entrada de las raicillas dorsales, asegúrese de que la duramadre esté perforada en el sitio de la inyección.

Después de la perforación, el líquido cefalorraquídeo duracéfano secará la superficie del cordón y toda la exposición con una gasa o un aplicador con punta de algodón. Use fórceps para agarrar y levantar ligeramente la duramadre de la médula espinal sin pellizcar ni lesionar la médula espinal. Extienda la incisión ligeramente en el eje cordal rostral con una jeringa de aguja removible tipo gast Hamilton de 10 microlitros.

Equipado con una aguja Hamilton de metal biselado de calibre 33 y 45 grados. Cargue lentamente el volumen requerido de suspensión celular para un sitio de inyección. Baje la punta de la aguja hacia la superficie dorsal de la médula espinal mientras monitorea su progreso a través del microscopio.

Alinee la jeringa con el eje de la columna vertebral para dirigirse correctamente a la región anatómica deseada, apuntando la aguja lo más cerca posible de los 90 grados y justo medial a la zona de entrada de las raicillas dorsales. Toque suavemente la superficie de la médula espinal con la punta de la aguja, presionando ligeramente la médula espinal con la punta de la aguja. A continuación, retraiga la aguja hasta que la médula espinal vuelva a su posición normal.

Registre esta posición como Z igual a 0.0 usando la regla en el micro manipulador. A continuación, mientras monitorea visualmente el progreso a través del microscopio, baje ligeramente la aguja en la médula espinal. Baje la aguja para adaptar los 1,5 milímetros para apuntar al cuerno ventral en una rata adulta.

Deje la aguja en su lugar durante dos a cinco minutos antes de comenzar la inyección. Asegúrese de que la configuración quirúrgica permanezca inalterada durante este tiempo. A continuación, inyecte dos microlitros de células durante dos a cinco minutos a una velocidad constante utilizando el controlador de la bomba después de la inyección, deje la aguja en su lugar durante dos a cinco minutos.

A continuación, retire con cuidado la aguja de la médula espinal. Repita el proceso de inyección para otros sitios de destino. Una vez que se hayan inyectado todos los sitios objetivo, vuelva a colocar el microscopio en el aumento y la sutura más bajos.

Cerró las tres capas musculares suprayacentes a la vez con cuatro músculos de sutura cero en tres ubicaciones en el eje del cordón rostral. Engrapa la piel cerrada con pinzas de nueve milímetros, asegurándote de que las grapas estén espaciadas aproximadamente 0,5 centímetros entre sí. Apriete las grapas con portaagujas para evitar que el animal se las quite antes de la cicatrización completa de la herida.

Aplique la solución antiséptica IRD de povidona en el área de la herida de la incisión con una gasa empapada y deje que el animal se recupere de la anestesia en una almohadilla de agua tibia circulante. Continuar con las inyecciones diarias de ciclosporina A o FK 5 0 6 rapamicina hasta que llegaran 50.000 ratones. Las células progenitoras de glio se trasplantaron al asta ventral de la médula espinal nivel C 4 en una SOD uno G 93 una rata.

Esta imagen muestra que llegaron dos ratones M positivos, las células trasplantadas sobrevivieron un mes después del trasplante y que las células se localizaron en la sustancia gris ventral, pero el sitio de la inyección no alcanzó medialmente el asta ventral lateral como lo denota la línea punteada. Como se ve aquí, la inyección de un número mucho mayor de células en esta región provoca daños en el lugar de la inyección y a lo largo de la pista de la aguja. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente 45 a 60 minutos para seis sitios de inyección si se realiza correctamente.