Name: Intraespinal trasplante de células de Orientación asta ventral del cuello uterino en la esclerosis lateral amiotrófica y la lesión de la médula espinal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Aprenda el trasplante intramedular de precursores neuronales en la médula espinal cervical de roedores para proteger motoneuronos frénicos en modelos de ELA y lesión medular. Este protocolo detallado facilita estudios de regeneración neurológica.

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Me gustaría dar las gracias a: todos los miembros de la Lepore, Sergios y los laboratorios de Rothstein útil para el debate; El Veteranos Paralizados de América y la Fundación Craig H. Neilsen para su financiación.

<ol><li>Lane, M. A., Fuller, D. D., White, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+recovery+following+high+cervical+hemisection%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Respiratory recovery following high cervical hemisection.</a> Trends in neurosciences. 31, 538-538 (2008).</li>
<li>Kaplan, L. M., Hollander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+dysfunction+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chest.+Med%22%5BJournal%5D)">Respiratory dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Clin. Chest. Med. 15, 675-675 (1994).</li>
<li>Miller, R. G., Rosenberg, J. A., Gelinas, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practice+parameter%3A+the+care+of+the+patient+with+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28an+evidence-based+review%29%3A+report+of+the+Quality+Standards+Subcommittee+of+the+American+Academy+of+Neurology%3A+ALS+Practice+Parameters+Task+Force%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Practice parameter: the care of the patient with amyotrophic lateral sclerosis (an evidence-based review): report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology: ALS Practice Parameters Task Force.</a> Neurology. 52, 1311-1323 (1999).</li>
<li>Mitsumoto, H., Chad, D. A., Pioro, E. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMitsumoto%2C+H+%22Amyotrophic+lateral+sclerosis%22">Amyotrophic lateral sclerosis</a>. Davis, F. A. , Philadelphia. (1998).</li>
<li>Tandan, R., Bradley, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyotrophic+leteral+sclerosis%3A+Part+2.+Etiopathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+neurology%22%5BJournal%5D)">Amyotrophic leteral sclerosis: Part 2. Etiopathogenesis.</a> Annals of neurology. 18, 419-419 (1985).</li>
<li>Bruijn, L. I., Miller, T. M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+mechanisms+involved+in+motor+neuron+degeneration+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Unraveling the mechanisms involved in motor neuron degeneration in ALS.</a> Annu Rev Neurosci. 27, 723-723 (2004).</li>
<li>Rosen, D. R., Siddique, T., Patterson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+Cu%2FZn+superoxide+dismutase+gene+are+associated+with+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis.</a> Nature. 362, 59-59 (1993).</li>
<li>Bruijn, L. I., Becher, M. W., Lee, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALS-linked+SOD1+mutant+G85R+mediates+damage+to+astrocytes+and+promotes+rapidly+progressive+disease+with+SOD1-containing+inclusions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions.</a> Neuron. 18, 327-327 (1997).</li>
<li>Gurney, M. E., Pu, H., Chiu, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu%2CZn+superoxide+dismutase+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264, 1772-1775 (1994).</li>
<li>Howland, D. S., Liu, J., She, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+loss+of+the+glutamate+transporter+EAAT2+in+a+transgenic+rat+model+of+SOD1+mutant-mediated+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28ALS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Focal loss of the glutamate transporter EAAT2 in a transgenic rat model of SOD1 mutant-mediated amyotrophic lateral sclerosis (ALS).</a> Proc Natl Acad Sci. 99, 1604-1604 (2002).</li>
<li>Nagai, M., Aoki, M., Miyoshi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rats+expressing+human+cytosolic+copper-zinc+superoxide+dismutase+transgenes+with+amyotrophic+lateral+sclerosis%3A+associated+mutations+develop+motor+neuron+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rats expressing human cytosolic copper-zinc superoxide dismutase transgenes with amyotrophic lateral sclerosis: associated mutations develop motor neuron disease.</a> J. Neurosci. 21, 9246-9246 (2001).</li>
<li>McDonald, W., Becker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+injury%3A+promising+interventions+and+realistic+goals%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Phys.+Med.+Rehabi%22%5BJournal%5D)">Spinal cord injury: promising interventions and realistic goals.</a> Am. J. Phys. Med. Rehabi. I82, S38-S38 (2003).</li>
<li>Sandrow-Feinberg, H. R., Zhukareva, V., Santi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEGylated+interferon-beta+modulates+the+acute+inflammatory+response+and+recovery+when+combined+with+forced+exercise+following+cervical+spinal+contusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+neurology%22%5BJournal%5D)">PEGylated interferon-beta modulates the acute inflammatory response and recovery when combined with forced exercise following cervical spinal contusion injury.</a> Experimental neurology. 223, 439-451 (2010).</li>
<li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mammalian neural stem cells.</a> Science. 287, 1433-1433 (2000).</li>
<li>Lane, M. A., Lee, K. Z., Fuller, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+circuitry+and+respiratory+recovery+following+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+physiology+%26+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Spinal circuitry and respiratory recovery following spinal cord injury.</a> Respiratory physiology & neurobiology. 169, 123-123 (2009).</li>
<li>Lepore, A. C., Rauck, B., Dejea, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+transplantation-based+astrocyte+replacement+is+neuroprotective+in+a+model+of+motor+neuron+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease.</a> Nature. 11, 1294-1294 (2008).</li>
<li>Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+and+Restricted+Precursors+in+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Multipotent and Restricted Precursors in the Central Nervous System.</a> Anat Rec. 257, 137-137 (1999).</li>
<li>Rao, M. S., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial-+restricted+precursors+are+derived+from+multipotent+neuroepithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Glial- restricted precursors are derived from multipotent neuroepithelial stem cells.</a> Dev Biol. 188, 48-48 (1997).</li>
<li>Suzuki, M., Tork, C., Shelley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+dimorphism+in+disease+onset+and+progression+of+a+rat+model+of+ALS.+Sexual+dimorphism+in+disease+onset+and+progression+of+a+rat+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Amyotroph+Lateral+Scler%22%5BJournal%5D)">Sexual dimorphism in disease onset and progression of a rat model of ALS. Sexual dimorphism in disease onset and progression of a rat model of ALS.</a> Amyotroph Lateral Scler. 8, 20-20 (2007).</li>
<li>Lepore, A. C., Haenggeli, C., Gasmi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraparenchymal+spinal+cord+delivery+of+adeno-associated+virus+IGF-1+is+protective+in+the+SOD1G93A+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Intraparenchymal spinal cord delivery of adeno-associated virus IGF-1 is protective in the SOD1G93A model of ALS.</a> Brain research. 1185, 256-256 (2007).</li>
<li>Veldink, J. H., Bar, P. R., Joosten, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+differences+in+onset+of+disease+and+response+to+exercise+in+a+transgenic+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Sexual differences in onset of disease and response to exercise in a transgenic model of ALS.</a> Neuromuscul Disord. 13, 737-737 (2003).</li>
<li>Shumsky, J. S., Lepore, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+Neuronal+and+Glial+Restricted+Precursors+into+Contused+Spinal+Cord+Improves+Bladder+and+Motor+Functions%2C+Decreases+Thermal+Hypersensitivity%2C+and+Modifies+Intraspinal+Circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transplantation of Neuronal and Glial Restricted Precursors into Contused Spinal Cord Improves Bladder and Motor Functions, Decreases Thermal Hypersensitivity, and Modifies Intraspinal Circuitry.</a> J. Neurosci. 25, 9624-9624 (2005).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Para estudios con ratones SOD1 G93A y ratas, la edad y el sexo coinciden con los animales dentro de un grupo, y distribuir los animales dentro de la misma camada de los diferentes grupos. Es preferible utilizar todos los animales del mismo sexo, tanto para la ELA y modelos SCI porque los procesos de la enfermedad pueden diferir entre hombres y mujeres, sin embargo, también puede ser útil disponer de suficientes animales de ambos sexos, para detectar posibles efectos específicos del sexo, como este fenómeno se...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14170 </td></tr><tr><td> 0,05% de tripsina </td><td> Gibco </td><td> 25300 </td></tr><tr><td> Inhibidor de tripsina de soja (opcional) </td><td> Sigma </td><td> T-6522 </td></tr><tr><td> Acepromacina maleato (0,7 mg / kg) </td><td> Fermentación de Sanidad Animal </td><td></td></tr><tr><td> La ketamina (95 mg / kg) </td><td> Fort Dodge Animal Health </td><td></td></tr><tr><td> Xilazina (10 mg / kg) </td><td> Bayer </td><td></td></tr><tr><td> # 11 pluma quirúrgica hoja </td><td> Microscopía electrónica de Ciencias </td><td> 72044-11 </td></tr><tr><td> Bastoncillos de algodón (6 pulgadas) </td><td> Pescador </td><td> 23-400-101 </td></tr><tr><td> Rata de dientes con fórceps </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> Rata: 11023-15; Mouse: 11042-08 </td></tr><tr><td> De tamaño mediano tijeras primavera </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 15012-12 </td></tr><tr><td> Mini primavera tijera </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 15000-10 </td></tr><tr><td> Gubia </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> Rata: 16121-14; Mouse: 16221-14 </td></tr><tr><td> Microknife </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 10056-12 </td></tr><tr><td> Los porta-agujas </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 12502-14 </td></tr><tr><td> Sutura: 4-0 </td><td> Vicryl </td><td> S-183 </td></tr><tr><td> Staples: 9 mm </td><td> Autoclip </td><td> 427631 </td></tr><tr><td> Grapadora: 9 mm (Reflex # 203-1000) </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> 5000344 </td></tr><tr><td> Bomba de agua tibia (T / bomba) </td><td> Gaymar </td><td> P / N 07999-000 </td></tr><tr><td> Ciclosporina A: 250.0 mg/5.0 ml ampollas </td><td> Novartis / Sandimmune </td><td> NDC 0078-0109-01 </td></tr><tr><td> FK-506 </td><td> LC Laboratorios </td><td> F-4900 </td></tr><tr><td> La rapamicina </td><td> LC Laboratorios </td><td> R-5000 </td></tr><tr><td> Inyector </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> UMP2 </td></tr><tr><td> Micro 4 Controlador de la bomba Microjeringa </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> UMC4 </td></tr><tr><td> Micromanipulador </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> Kite-R </td></tr><tr><td> 10,0 l jeringa Hamilton </td><td> Hamilton </td><td> 80030 </td></tr><tr><td> Hamilton agujas: 33-calibre 45 de bisel °, 1 pulgada </td><td> Hamilton </td><td> 7803-05 </td></tr><tr><td> Vidrio 20,0 l pipetas microcapilares (opcional) </td><td> Kimble </td><td> 71900-20 </td></tr></tbody></table>

intraespinal trasplante de células de orientación asta ventral del cuello uterino en la esclerosis lateral amiotrófica y la lesión de la médula espinal

Intraspinal Cell Transplantation for Targeting Cervical Ventral Horn in Amyotrophic Lateral Sclerosis and Traumatic Spinal Cord Injury

Compromiso respiratorio debido a la pérdida de neuronas motoras frénico es una consecuencia debilitantes de una gran proporción de los derechos humanos lesión de la médula espinal (LME) de los casos 1 y es la causa última de muerte en pacientes con la enfermedad de la neurona motora, esclerosis amiotrófica laterales (ALS) 2. La ELA es una enfermedad devastadora neurológico que se caracteriza por la degeneración relativamente rápido de la parte superior y las neuronas motoras inferiores. Los pacientes finalmente sucumben a la enfermedad en promedio 5.2 años después del diagnóstico debido a la parálisis respiratoria debido a la pérdida de las neuronas motoras innnervation frénico del diafragma 3. La gran mayoría de los casos son esporádicos, mientras que el 10% son de la forma familiar. Aproximadamente el veinte por ciento de los casos familiares están vinculados a las mutaciones puntuales en el gen de varios Cu / Zn superóxido dismutasa 1 (SOD1) en el cromosoma 21 4. Los ratones transgénicos y ratones 4,5 6 llevar humana mutante SOD1 genes (G93A, G37R, G86R, G85R) se han generado, y, a pesar de la existencia de otros modelos animales de la pérdida de neuronas motoras, son actualmente los modelos más usadas de la enfermedad . Lesión de la médula espinal (SCI) es un conjunto heterogéneo de condiciones que resultan de un trauma físico a la médula espinal, con el resultado funcional que varían según el tipo, localización y gravedad de la lesión 7. Sin embargo, aproximadamente la mitad de los casos humanos de SCI afecta a las regiones cervical, lo que resulta en disfunción respiratoria debilitante debido a la pérdida de motoneuronas frénico y lesiones a descender los axones bulboespinal respiratorias 1. Una serie de modelos animales de LME se han desarrollado, con el más comúnmente usado y clínicamente relevantes, siendo la contusión 8. El trasplante de las distintas clases de células precursoras neurales (NPC) es una estrategia terapéutica prometedora para el tratamiento de lesiones traumáticas del SNC y la neurodegeneración, incluyendo la ELA y SCI, debido a la posibilidad de sustituir la neuroprotección perdido o proporcionar SNC disfuncionales tipos de células, y entregar los factores genéticos, de interés del 9. Los modelos animales de ELA y dos SCI pueden modelar muchos aspectos clínicamente relevantes de estas enfermedades, incluyendo la pérdida de las neuronas motoras frénico y el compromiso consecuente respiratorias 10,11. Con el fin de evaluar la eficacia de las estrategias basadas en la APN sobre la función respiratoria en estos modelos animales de ELA y SCI, las intervenciones de celulares deben ser dirigidos específicamente a las regiones que contienen los objetivos terapéuticos relevantes, tales como las neuronas motoras frénico. Ofrecemos un protocolo detallado para multi-segmentaria, el trasplante de intraespinal de NPCs en la cervical de la médula espinal ventral materia gris de los modelos neurodegenerativos como la SOD1 G93A ratones y ratas, así como la médula espinal lesionada ratas y ratones 11.

El trasplante de precursores neuronales es una estrategia prometedora para la protección y / o reemplazar la pérdida / disfuncional neuronas cervical motor frénico en lesiones de médula espinal (LME) y el trastorno de la neurona motora, esclerosis amiotrófica laterales (ALS). Ofrecemos un protocolo para la entrega de celulares a cuerno ventral de la médula espinal cervical en modelos de roedores de la ELA y la médula espinal.

Intraespinal trasplante de células de Orientación asta ventral del cuello uterino en la esclerosis lateral amiotrófica y la lesión de la médula espinal

El compromiso respiratorio debido a la pérdida de neuronas motoras frénicas es una consecuencia debilitante de una gran proporción de las lesiones medulares (LM) traumáticas humanas...

El objetivo general de este procedimiento es realizar un trasplante multisegmentario intrarraquídeo de células precursoras neuronales en la médula espinal cervical, en la sustancia gris ventral de ratas y ratones. Para lograrlo, primero se prepara el tipo de célula precursora neuronal de interés para el trasplante. Luego, se realiza una laminectomía en la médula espinal en cada punto donde se pretende realizar la trasplantación celular.A continuación, las células se inyectan adecuadamente en las ubicaciones y profundidades apropiadas para dirigir con precisión la administración de células a la asta ventral de la médula espinal cervical. El paso final consiste en continuar administrando supresión inmunitaria al animal hasta el sacrificio, con el fin de lograr la supervivencia de las células trasplantadas en la médula espinal. En última instancia, se pueden obtener resultados para rastrear la supervivencia, migración y diferenciación de las células precursoras neurales trasplantadas en la médula espinal cervical adulta en diversos momentos posteriores al trasplante, mediante métodos histológicos como la inmunohistoquímica y el análisis subsiguiente por microscopía.La demostración visual en este método es fundamental, ya que muchos de los pasos quirúrgicos complejos en la médula espinal y de trasplante celular son difíciles de aprender porque requieren gran cuidado y técnicas específicas, y su realización se facilita con esta demostración. Si se emplean los procedimientos recomendados, inmunosuprima al animal tres días antes del trasplante mediante inyecciones diarias de 10 miligramos por kilogramo de peso corporal de ciclosporina A por vía subcutánea. Si se van a trasplantar células derivadas de roedores, o un miligramo por kilogramo de peso corporal de FK506 y rapamicina por vía intraperitoneal.Si se van a trasplantar células de origen humano, también moldee clips de papel resistentes para formar retractores. Rompa una parte del clip para hacer un gancho y doble el otro extremo del clip en un pequeño lazo. Luego, ate un cordel a través del lazo de cada retractor, y autóclave los retractores y todos los instrumentos que se utilizarán en la cirugía el día de la intervención.Prepare alícuotas de células progenitoras gliales u otras células que se vayan a trasplantar según los procedimientos descritos en el protocolo escrito. Una vez que se hayan recolectado las células, distribuya las suspensiones celulares entre varios tubos microcentrífugos de 1,5 mililitros y manténgalos sobre hielo húmedo. Luego, tras administrar un método adecuado de anestesia al animal, confirme que se ha alcanzado un nivel anestésico adecuado para la cirugía realizando una compresión del dedo del pie.Utilice una afeitadora eléctrica para afeitar la espalda del animal, afeitando bien el pelo desde una zona ligeramente rostral a las orejas hasta la mitad de la espalda del animal, y retire el pelo cortado de la piel para evitar que entre en la incisión. A continuación, empape un trozo de gasa con solución antiséptica de povidona y yodo y aplíquela sobre la piel en la zona afeitada. Frote al menos dos veces con la solución antiséptica y dos veces con alcohol o desinfectante diluido, de manera circular.Comenzando en el sitio de la incisión y dirigiéndose hacia afuera, en dirección a la línea del cabello. Coloque una gasa estéril enrollada sobre una tabla quirúrgica limpia y sujétela con cinta adhesiva para que no se mueva. Coloque al animal encima de la gasa enrollada en posición de feto.Extienda ambos brazos del animal sobre la almohadilla y luego sujételos con cinta adhesiva a la almohadilla y a la tabla quirúrgica para elevar la médula espinal cervical. Esto facilitará el trabajo durante toda la cirugía, ya que el cordón cervical se encuentra profundo debajo de la superficie de la piel. Se debe utilizar un campo quirúrgico estéril durante este procedimiento, aunque esto no se muestra en el video por motivos de demostración.Primero, observando a través de un microscopio quirúrgico ajustado al aumento más bajo, utilice un escalpelo estéril y afilado para realizar una incisión media desde la base del cráneo hasta la escápula. Luego, realice una incisión a través de las tres capas musculares sobre la columna vertebral. Aplique suficiente presión para cortar todas las capas musculares con el mínimo número de cortes, pero no presione demasiado, ya que esto podría causar daño en los tejidos más profundos con dos aplicadores de algodón.Utilice un movimiento de torsión para separar el músculo superficial del músculo paravertebral. No corte ni desgarre el músculo, ya que esto provocará hemorragia. Coloque cuatro de los retractores caseros en posición para retraer el músculo.Luego, tire de cada uno de los cuatro retractores hacia las cuatro esquinas y sujete los hilos al tablero con cinta adhesiva para fijar el retractor. La exposición final debe tener forma cuadrada o rectangular. Utilice pinzas con dientes de rata y tijeras de resorte de tamaño mediano para retirar el músculo paravertebral de la superficie dorsal de las vértebras.Realice los cortes muy cerca del hueso para exponer mejor la superficie ósea. Asegúrese de que los cortes sean paralelos a la superficie de las vértebras, pero no corte hacia la médula. Cambie las tijeras de resorte de tamaño mediano por una tijera para tejidos crudos.Luego, asegure toda la columna vertebral sujetando el músculo sobre la apófisis C dos con pinzas dentadas y utilice la tijera para separar el músculo a los niveles C cuatro, C cinco y C seis. A continuación, comience una laminectomía en C cinco. Nuevamente, asegure el área sujetando C dos con pinzas dentadas.Sujete toda la lámina con la pinza cruenta y coloque la pinza de modo que la herramienta quede completamente perpendicular al eje de la columna vertebral. Aplaste lentamente y con suavidad la lámina sin presionar hacia abajo sobre la médula espinal. Luego, tire suavemente hacia arriba del fragmento óseo roto.A continuación, coloque el gerr crudo perpendicular a la columna espinal. Luego inserte suavemente el gerr crudo debajo del hueso con un ángulo de 30 a 60 grados con respecto a la superficie de la médula. Haga cortes pequeños para extender la laminectomía a todas las láminas de C4 a C6.No extienda la laminectomía demasiado lateralmente, ya que esto causará hemorragia. Aumente la magnificación del microscopio a aproximadamente 15 x y enfoque en la médula. Use un bisturí recto y afilado.Utilice fórceps número cinco para limpiar el tejido conectivo situado encima de la duramadre. Luego, use tijeras pequeñas de resorte o un microcuchillo para incisionar la duramadre en paralelo al eje de la columna vertebral. A partir de un punto ligeramente medial a la zona de entrada de las raíces dorsales, asegúrese de que la duramadre sea perforada en el sitio de la inyección.Después de perforar, el líquido cefalorraquídeo saldrá y secará la superficie de la médula espinal; absorba todo el área expuesta con gasa o un aplicador con punta de algodón. Utilice pinzas para agarrar y levantar ligeramente la duramadre lejos de la médula espinal sin pellizcar ni dañar la médula espinal. Extienda ligeramente la incisión a lo largo del eje cordal rostral utilizando una jeringa desmontable de tipo Hamilton de 10 microlitros con aguja gastada.Equipado con una aguja metálica Hamilton de 33 gauge y bisel de 45 grados. Cargue lentamente el volumen requerido de la suspensión celular para un sitio de inyección. Baje la punta de la aguja hacia la superficie dorsal de la médula espinal mientras monitorea su progreso a través del microscopio.Alinee la jeringa con el eje de la columna espinal para dirigirse correctamente a la región anatómica deseada, apuntando la aguja lo más cerca posible de 90 grados y justo medial a la zona de entrada de las raíces dorsales. Toque suavemente la superficie de la médula espinal con la punta de la aguja, deprimiendo ligeramente la médula espinal con la punta de la aguja. Luego, retire la aguja hasta que la médula espinal regrese a su posición normal.Registre esta posición como Z igual a 0,0 utilizando la regla del micromanipulador. A continuación, mientras observa visualmente el progreso a través del microscopio, baje ligeramente la aguja hacia la médula espinal. Baje la aguja 1,5 milímetros para dirigirla hacia el cuerno ventral en una rata adulta.Deje la aguja en su lugar durante dos a cinco minutos antes de comenzar la inyección. Asegúrese de que el instrumental quirúrgico permanezca intacto durante este tiempo. A continuación, inyecte dos microlitros de células durante dos a cinco minutos a un ritmo constante utilizando el controlador de la bomba; después de la inyección, deje la aguja en su lugar durante dos a cinco minutos.Luego retire cuidadosamente la aguja de la médula espinal. Repita el proceso de inyección en otros sitios diana. Una vez que se hayan inyectado todos los sitios diana, regrese el microscopio a la menor magnificación y realice la sutura.Cierre las tres capas musculares superpuestas simultáneamente con sutura de número cero en cuatro puntos, en tres ubicaciones a lo largo del eje cordal rostral. Cierre la piel con grapas quirúrgicas de nueve milímetros, asegurándose de que las grapas estén separadas aproximadamente 0,5 centímetros entre sí. Ajuste las grapas con pinzas portaagujas para evitar que el animal se las arranque antes de que la herida sane completamente.Aplique la solución antiséptica de povidona IRD en el área de la herida quirúrgica con gasa empapada y permita que el animal se recupere de la anestesia sobre una almohadilla de agua tibia circulante. Continúe con inyecciones diarias de ciclosporina A o FK506 y rapamicina hasta la eutanasia; llegaron 50 000 ratones. Las células progenitoras de gliocitos se trasplantaron en el cuerno ventral del nivel medular C4 en una rata SOD1G93A.Esta imagen muestra que en el ratón M dos positivo llegaron células trasplantadas, las cuales sobrevivieron un mes después del trasplante y se localizaron en la sustancia gris ventral, pero el sitio de inyección no alcanzó medialmente el cuerno ventral lateral, como indica la línea punteada. Como se observa aquí, la inyección de un número mucho mayor de células en esta región provoca daño en el sitio de inyección y a lo largo del trayecto de la aguja. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente de 45 a 60 minutos para seis sitios de inyección si se realiza adecuadamente.

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El trasplante de células madre neurales (NSC) en la médula espinal de ratones con desmielinización establecido se detalla. La preparación de los comités directivos nacionales, la laminectomía de vértebra torácica 9 (T9), y el trasplante de NSCs se perfila, junto con la atención pre y post-operatorio de los ratones.

El trasplante quirúrgico de células madre neurales en la médula espinal de los ratones infectados con el virus neurotrópico Hepatitis Ratón

Fuente: Zweckberger, K., et al. Uso sinérgico de células precursoras neurales y péptidos autoensamblables en lesiones experimentales de la médula espinal cervical.  J. Vis. Exp. (2015).Este protocolo demuestra un enfoque de inyección dirigida para la reparación de lesiones de la médula espinal en un modelo de rata. Implica la administración de péptidos autoensamblables (SAP) en el núcleo de la lesión para crear un andamio de soporte, seguido de inyecciones de células precursoras neurales (NPC)...

Inyección de péptidos autoensamblables y células precursoras neurales para la reparación de la médula espinal en un modelo de rata

Matrices de fibrina que contienen factores de crecimiento se utilizaron para conservar las células madre neurales injertadas en los sitios de la transección completa de la médula espinal. Células injertadas llenaron completamente la cavidad de la lesión y diferenciarse en múltiples tipos de células neuronales, incluyendo las neuronas que se extendían axones en la médula espinal de acogida a través de largas distancias.

Promoción de la supervivencia y la diferenciación de células madre neurales con fibrina y factor de crecimiento cócteles después de la médula espinal severa lesión

El tratamiento de la lesión de la médula espinal cervical con péptidos autoensamblables (SAP) y células precursoras neurales (NPC), junto con factores de crecimiento, es un enfoque prometedor para promover la regeneración y la recuperación. Se establece un modelo de clip de aneurisma de contusión/compresión en ratas de LM cervical y tratamiento combinado que incluye inyección de SAP y trasplante de NPC.

El uso sinérgico de las células precursoras neuronales y Péptidos de autoensamblaje en Experimental cervical Lesión de la Médula Espinal

Lesión de la médula espinal es una condición traumática que causa morbilidad severa y alta mortalidad. En este trabajo se describe en detalle un modelo contusión de lesión de la médula espinal en ratones seguido de un trasplante de células madre neurales.

Neural Trasplante de células madre en Experimental contuso Modelo de Lesión de la Médula Espinal

Las lesiones graves de la médula espinal suelen provocar defectos en los tejidos. Se describen dos posibilidades para cerrar con éxito dichas brechas para promover la adaptación de los tejidos, las respuestas regenerativas y la mejora funcional en ratas mediante la implantación de un sistema de microconectores mecánicos después de una lesión aguda y cinco semanas después de la transección completa de la médula espinal.

Las estrategias experimentales para llenar los vacíos grandes de tejido de la médula espinal lesionada espinal después de la lesión aguda y crónica

Este artículo describe una técnica para insertar un tubo hueco entre los tocones de la médula espinal después de la transección completa y se llenan de células de Schwann (SCs) y matriz inyectable la membrana del sótano para salvar y promover la regeneración del axón a través de la brecha.

Trasplante de Schwann las células dentro de conductos de PVDF-TrFE a puente tocones de médula espinal de rata seccionado para promover la regeneración del axón a través de la brecha

En este artículo, proporcionamos un método reproducible para generar y mantener cortes organotípicos de la médula espinal a largo plazo trasplantados con células madre neurales como modelo ex vivo para probar terapias de reemplazo celular.

Cultivo a largo plazo de cortes organotípicos de médula espinal de ratón como plataforma para validar el trasplante de células en lesiones de la médula espinal

En este estudio, se desarrollaron y caracterizaron hidrogeles compuestos miméticos nerviosos que se pueden utilizar para investigar y capitalizar el comportamiento pro-regenerativo de las células madre derivadas del tejido adiposo para la reparación de lesiones de la médula espinal.

Desarrollo de terapias combinatorias para la lesión de la médula espinal mediante la administración de células madre

El presente protocolo describe el desarrollo de un modelo murino reproducible de glioma de médula espinal mediante la inyección de células tumorales en el espacio intervertebral, ofreciendo un enfoque más eficaz y menos invasivo para la investigación y el desarrollo terapéutico.

Trasplante quirúrgico de células tumorales en la médula espinal de ratones

Aprenda el trasplante intramedular de precursores neuronales en la médula espinal cervical de roedores para proteger motoneuronos frénicos en modelos de ELA y lesión medular. Este protocolo detallado facilita estudios de regeneración neurológica.

Intraespinal trasplante de células de Orientación asta ventral del cuello uterino en la esclerosis lateral amiotrófica y la lesión de la médula espinal (Video) | JoVE Journal

Intraespinal trasplante de células de Orientación asta ventral del cuello uterino en la esclerosis lateral amiotrófica y la lesión de la médula espinal

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