Imágenes en tiempo real de la fagocitosis de macrófagos de glóbulos rojos opsonizados con IgG

Tome una diapositiva de canal que contenga macrófagos de ratón. El canal se conecta a depósitos llenos de medios, suministrando nutrientes a los macrófagos.

Reemplace los medios con anticuerpos marcados con fluorescencia que contengan medios, que se unen a glicoproteínas de superficie específicas, marcando macrófagos.

Tome glóbulos rojos humanos, RBC, con membranas celulares marcadas con fluorescencia. Opsoniza los glóbulos rojos con anticuerpos IgG de ratón, que se unen específicamente a la glicoforina A.

Agregue los glóbulos rojos opsonizados con IgG al portaobjetos que contiene macrófagos. Los receptores Fc de macrófagos se unen a la región Fc de las IgG en los glóbulos rojos, lo que da como resultado la agrupación de receptores Fc alrededor del área de contacto y marca los glóbulos rojos para la fagocitosis.

La unión desencadena vías de señalización intracelular y activa GTPasas. Las GTPasas activadas impulsan la reorganización y polimerización de la actina, formando protuberancias delgadas de membrana denominadas filopodios.

Además, los filopodios se extienden alrededor de los glóbulos rojos, encerrándolos dentro de la copa fagocítica en desarrollo. Los bordes de la copa se fusionan, formando un fagosoma que internaliza los glóbulos rojos opsonizados para su degradación.

Usando un microscopio confocal, obtenga imágenes de lapso de tiempo de eventos fagocíticos individuales.

Para etiquetar los macrófagos peritoneales, reemplace el medio de bicarbonato en cada portaobjetos de canal con medio completo complementado con HEPES, e incline el portaobjetos para permitir que se agreguen 100 microlitros del anticuerpo específico de macrófagos de ratón marcado con fluorescencia en forma de gota a la abertura del canal de 100 microlitros del portaobjetos. Aspire el medio que fluye hacia el depósito aguas abajo e incube las células durante 20 minutos en una cámara húmeda a 37 grados centígrados en ausencia de dióxido de carbono.

Mientras se etiquetan las células peritoneales, mezcle suavemente la muestra de 4 a 2,000 glóbulos rojos y transfiera 400 microlitros de las células a un nuevo tubo de microcentrífuga de 2 mililitros en un bloque de aluminio calentado dentro de una campana de flujo laminar durante aproximadamente 5 a 8 minutos.

Cuando las células se hayan calentado a 37 grados Celsius, mezcle 0,4 microlitros de una tinción de membrana plasmática fluorescente roja apropiada con las células y vuelva a colocar las células en el bloque de calor. Después de 5 minutos, lave las células agregando 1,6 mililitros de medio completo fresco suplementado con HEPES y centrifugue. Gire el tubo para identificar el gránulo de glóbulos rojos.

Con una punta de pipeta de 1 a 1,5 mililitros, retire con cuidado el sobrenadante en dos volúmenes sin alterar el gránulo. Luego, mezcle 2,000 microlitros de medio completo fresco suplementado con HEPES con las células. Centrifugar y resuspender el pellet en 400 microlitros de medio. Luego, etiquete el tubo PMS para tinción de membrana plasmática. Al final de la incubación de etiquetado de células peritoneales de 20 minutos, lave el portaobjetos con 1 mililitro de medio fresco completo suplementado con HEPES.

Para opsonizar los glóbulos rojos, agregue 1 microlitro de anticuerpo monoclonal IgG2b anti-CD235a humano de ratón al tubo de muestra del SPM. Después de 8 minutos a 37 grados Celsius con mezcla una vez por minuto, transfiera 100 microlitros de glóbulos rojos humanos opsonizados con IgG teñidos con membrana plasmática al portaobjetos del canal que contiene macrófagos peritoneales. Tan pronto como se hayan agregado los glóbulos rojos humanos, monte el portaobjetos en un microscopio confocal de disco giratorio con la incubadora de escenario ajustada a 37 grados Celsius e inmediatamente, comience a obtener imágenes de las células.