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Inmunología
0 vistas • 2:53 min • July 8th, 2025
Para comenzar, tome un tubo que contenga células cancerosas en medios sin suero para minimizar la interferencia de esterasa sérica durante el ensayo. Incubar con colorante AM de calceína no fluorescente.
Las esterasas intracelulares activas hidrolizan la calceína AM en un colorante de calceína fluorescente impermeable a la membrana retenido en el citoplasma.
Células cancerosas teñidas con calceína en placa y células NK efectoras en los pocillos de prueba, mientras que los pocillos de control solo contienen células cancerosas teñidas con calceína sin células NK.
Los receptores activadores de la superficie celular de las células NK se unen a los ligandos activadores en las células cancerosas, formando una sinapsis inmune. Esta unión activa la señalización de las células NK, polarizando los gránulos citotóxicos que contienen perforinas y granzimas hacia la sinapsis para su liberación.
Las perforinas forman poros de la membrana de las células cancerosas, facilitando la entrada celular de granzimas e iniciando la apoptosis. La integridad comprometida de la membrana provoca fugas de calceína fluorescente, lo que reduce la fluorescencia de las células cancerosas.
Capture imágenes de fluorescencia de los pocillos.
Un menor número de células cancerosas vivas fluorescentes en los pocillos que contienen células NK que en los pocillos de control indica citotoxicidad mediada por células NK hacia las células cancerosas.
Para evaluar la citotoxicidad mediada por células NK utilizando AM de calcio, después de cultivar células de líneas celulares de cáncer de hígado humano a una confluencia de 70% a 80%, como se demostró, resuspender las células en 3 mililitros de DMEM sin suero y etiquetar las células con 1,5 microlitros de solución AM de calcio de 10 milimolares durante 30 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, recolecte las células por centrifugación y lave las células dos veces con 5 mililitros de PBS por lavado.
Vuelva a suspender las células a una concentración de 1 x 105 células por mililitro de medio de cultivo y agregue 100 microlitros de células a cada pocillo de una placa de 96 pocillos por triplicado según la condición de tratamiento. A continuación, agregue 1 x 10 5 células NK humanas en 100 microlitros de medio de cultivo a cada pocillo de células diana y coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante cuatro horas.
Una vez finalizada la incubación, capture al menos 10 campos diferentes de imágenes de las células positivas para AM de calcio para cada réplica de cada condición de tratamiento en un microscopio de fluorescencia con un aumento de 10 veces. Luego, calcule el porcentaje de citotoxicidad usando la fórmula.