JoVE Encyclopedia of Experiments
Inmunología
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Comience agregando quimioatrayentes, como una quimiocina, en una placa de pocillos múltiples.
Coloque una cámara permeable transpozo de un tamaño de poro apropiado en el pozo. Agregue suspensión celular asesina natural, o NK, a la cámara superior e incube.
Algunas moléculas de quimiocinas se difunden a través de la membrana y se unen a los receptores de células NK. Esto desencadena vías de señalización que promueven cambios citoesqueléticos, lo que resulta en un movimiento celular direccional hacia la mayor concentración de quimioatrayente en la cámara inferior.
Después de la incubación, transfiera un volumen fijo de células migradas desde la cámara inferior a un tubo de clasificación de células activado por fluorescencia o FACS. Agregue un número predeterminado de perlas de recuento fluorescentes y realice un recuento de células basado en FACS.
Con la siguiente fórmula, determine el número absoluto de células NK migradas en la muestra.
El diagrama de puntos da el número de cuentas de conteo y células separadas como regiones distintas, según sus propiedades de fluorescencia y dispersión.
Para medir la migración de células NK en respuesta a estímulos quimiotácticos, recolecte células NK humanas de un cultivo confluente del 70% al 80% y vuelva a suspender las células a una concentración de medio de cultivo de células NK libre de suero de 2,5 x 106 células por mililitro de suero libre de NO. A continuación, agregue 600 microlitros de medio sin suero que contenga el quimioatrayente de células NK de interés por pocillo.
Y coloque un inserto de cultivo de 6,5 milímetros de diámetro con poros de 5 micrómetros en cada pocillo de medio. Luego, agregue 100 microlitros de células NK al compartimento superior de cada inserto y coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante cuatro horas.
Al final de la incubación, transfiera todo el volumen de células migradas no adherentes desde el fondo de cada pocillo a tubos FACS individuales de 5 mililitros, y agregue 15 microlitros de un número predeterminado de perlas de conteo de citometría de flujo a cada tubo. Luego, usando un citómetro de flujo, evalúe cada muestra de células de acuerdo con los protocolos estándar de análisis de citometría de flujo y calcule el número absoluto de células NK migradas usando la fórmula.