Análisis de la eferocitosis de timocitos apoptóticos por macrófagos peritoneales

La eferocitosis es el proceso por el cual las células fagocíticas eliminan las células apoptóticas.

Para analizar la eferocitosis, obtenga timocitos de ratón susceptibles a la apoptosis. Incubar con colorante CFSE permeable a las células.

Las esterasas intracelulares escinden CFSE a un tinte fluorescente impermeable a las células, tiñendo timocitos. Agregue suero inactivado por calor para evitar manchas excesivas.

Coloque los timocitos teñidos en una placa de cultivo. Agregue estaurosporina, un inhibidor de la proteína quinasa, que interrumpe la cascada de señalización celular crítica, induciendo la apoptosis. Además, los residuos de fosfatidilserina se translocan a la valva externa de la membrana celular, funcionando como "señales de cómeme".

Agregue concentraciones crecientes de timocitos apoptóticos a pocillos de placas de múltiples pocillos que contienen macrófagos peritoneales de ratón activados, que expresan receptores específicos de tirosina quinasas.

Estas quinasas se unen a la fosfatidilserina expuesta en los timocitos apoptóticos, facilitando su internalización por los macrófagos.

Después de la incubación, elimine los timocitos apoptóticos que flotan libremente. Agregue anticuerpos anti-CD11b marcados con fluoróforos, que se unen a las moléculas CD11b de macrófagos.

Usando un microscopio de fluorescencia, observe timocitos apoptóticos fluorescentes dentro de diferentes macrófagos fluorescentes, lo que indica eferocitosis.

Los pocillos con concentraciones de timocitos apoptóticos más altas muestran un aumento de timocitos internalizados.

Para recolectar timocitos después de abrir la cavidad torácica de un ratón C57 / Black-6 ingenuo, use pinzas curvas de punta fina para extraer el timo. Coloque el órgano en una placa de cultivo de tejidos que contenga 10 mililitros de medio RPMI-1640. Muela todo el timo contra los extremos esmerilados de 2 portaobjetos de microscopio y filtre la suspensión de tejido resultante a través de un colador celular de 70 micrómetros en un tubo de 50 mililitros. Recoger los timocitos por centrifugación, y resuspender el pellet en 40 mililitros.

Después de contar, centrifugar las celdas nuevamente y volver a suspender hasta 2 x 10⁸ celdas en 20 mililitros de PBS fresco por tubo de 50 mililitros. Etiquete las células con CFSE de 5 micromolares en 20 mililitros de PBS por tubo. Invierta los tubos dos o tres veces para mezclar, antes de incubar los timocitos durante no más de 2 minutos a temperatura ambiente, protegidos de la luz. Al final de la incubación, detenga la reacción con 10 mililitros de suero de caballo inactivado por calor y recoja las células por centrifugación.

Vuelva a suspender las células marcadas en 40 mililitros de PBS fresco para su recuento y centrifugación, seguido de un lavado adicional con 40 mililitros de medio. Después del lavado del medio, vuelva a suspender los timocitos a una concentración de medio de cultivo de tejidos de 7 x 10⁶ células por mililitro y siembre las células en una placa de cultivo de tejidos de 100 milímetros. Luego, agregue estaurosporina al cultivo celular a una concentración final de 1 micromolar y coloque la placa en una incubadora de cultivo de tejidos durante 4 horas.

Para el aislamiento de macrófagos peritoneales, inyecte dos ratones C57 / Black-6 por vía intraperitoneal con 1 mililitro de tioglicolato envejecido al 3% en el día 0, antes de abrir la piel abdominal sin alterar el peritoneo el día 5.

Para enjuagar la cavidad peritoneal, use una jeringa de 10 mililitros equipada con una aguja de calibre 18 para empujar rápidamente 10 mililitros de tampón de lavado en la cavidad antes de aspirar lentamente el tampón de lavado para recogerlo en un tubo de 50 mililitros. Lave la sonda peritoneal dos veces con PBS. Vuelva a suspender los macrófagos peritoneales a una concentración de 2 veces 10 a seis células por mililitro de medio de cultivo de tejidos.

A continuación, siembre 500 microlitros de macrófagos en cada pocillo de una placa de 24 pocillos y coloque la placa en una incubadora de cultivo de tejidos durante 2 horas. Al final de la incubación, aspirar el sobrenadante para eliminar las células flotantes y agregar 500 microlitros de medio de cultivo de tejidos a cada pocillo.

Inmediatamente agregue de 0 a 12 x 10⁶ timocitos en 500 microlitros de medio a cada pocillo del cultivo, y coloque la placa en la incubadora de cultivo de tejidos durante 4 horas. Al final de la incubación, lave cada pocillo dos veces con PBS fresco para eliminar las células apoptóticas que flotan libremente, seguido de un solo lavado con tampón de tinción. A continuación, etiquete los macrófagos unidos a la placa con 200 microlitros de tampón de tinción suplementado con un anticuerpo anti-CD11b apropiado por pocillo y coloque la placa a 4 grados Celsius durante 20 minutos.